壹般來講，進行real-time qPCR MasterMix都是2×的濃縮液，只需要加入模板和引物就可以。由於real-time qPCR靈敏度高，所以每個樣品至少要做3個平行孔，以防在後面的數據分析中，由於Ct相差較多或者SD太大，無法進行統計分析。通常來講，反應體系的引 物終濃度為100-400mM；模板如果是總RNA壹般是10ng-500，如果cDNA，通常情況下是1ul或者1ul的10倍稀釋液，要根據目的基因 的表達豐度進行調整。當然這些都是經驗值，在操作過程中，還需要根據所用MasterMix，模板和引物的不同進行優化，達到壹個最佳反應體系。在反應體 系配置過程中，有下面幾點需要註意：
1. MasterMix不要反復凍融，如果經常使用，最好溶解後放在4度。
2. 更多的配制Mix進行，減少加樣誤差。最好能在冰上操作。
3. 每管或每孔都要換新槍頭！不要連續用同壹個槍頭加樣！
4. 所有成分加完後，離心去除氣泡。
5. 每個樣品至少3個平行孔。
參比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（現在已經是ABI的註冊商標了！）或者其他染料，只要不影響檢測PCR產物的熒光值就可以。參比染料的作用是標準化熒光定量 反應中的非PCR震蕩，校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差，提供壹個穩定的基線。現在很多公司已經把ROXTM配制在MasterMix或者 Premixture裏。如果反應曲線良好或已經優化好反應體系，也可以不加ROXTM染料校正。
通常來講，real-time qPCR的反應程序不需要像常規的PCR那樣，要變性、退火、延伸3步。由於其產物長度在80-150bp 之間，所以只需要變性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR擴增程序結束後，加壹個溶解程序，來形成溶解曲線，判斷PCR產物的特 異性擴增。而溶解程序，儀器都有默認設置，或稍有不同，但都是壹個在產物進行溶解時候，進行熒光信號的收集。
3. 儀器設置
所有儀器的操作都基本壹致。設置的時候包括反應板設置（plate setup）和程序設置（program setup）。我們以 ABI StepOne為例，詳細看壹下反應設置：
A. 首先是實驗目的選擇：定量還是其他。我們命名為“BioTeke”，進行“定量”實驗。
B. 實驗方法的選擇：我們選用的比較Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA為模板進行。
C. 目的基因的設置：有幾個目的基因和目的基因的名稱。
D. 樣品的設置：包括哪個是實驗組，哪個是對照組。以及負對照的設置和生物重復的設置。
E. 對照組和內參基因的設置：這個是為後面的定量做準備
F. 反應程序的設置：PCR反應程序的設置要根據不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分鐘就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10 分鐘）。循環反應是95℃15秒，60℃15秒的40個循環。溶解曲線程序采用儀器默認設置就可以。或者是儀器說明書上建議的程序。