詳情如下:
PCR-ELISA方法:
使用地高辛或生物素作為標記引物,擴增產物被固相板上的特異性探針結合。
然後加入抗地高辛或生物素化抗體-辣根過氧化物酶偶聯物,最後酶使底物顯色。
常規的PCR-ELISA只是定性實驗,加入內標,制作標準曲線也可以達到定量檢測的目的。
通過測量壹系列已知成分的標準物質的某種理化性質,得到由該性質的數值組成的曲線。
擴展數據:
實時熒光定量PCR技術,在PCR反應體系中加入熒光基團,通過熒光信號的積累實時監控整個PCR過程,最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析。
檢測方法:
1,SYBRGreen法:
在PCR反應體系中加入過量的SYBR熒光染料,SYBR熒光染料特異性地混入DNA雙鏈中,然後發出熒光信號。
而沒有摻入鏈中的SYBR染料分子不會發出任何熒光信號,從而保證了熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。
SYBR定量PCR擴增熒光曲線,PCR產物解鏈曲線(單峰圖表示PCR擴增產物的奇異性)。
2.TaqMan探針法:
當探針完整時,報告基團發出的熒光信號被淬滅基團吸收;
在PCR擴增過程中,Taq酶的5’-3’核酸外切酶活性降解探針,並將報告熒光基團與淬滅熒光基團分開,使得熒光監測系統可以接收熒光信號。
即每壹條DNA鏈都被擴增,形成壹個熒光分子,實現了熒光信號的積累和PCR產物的形成之間的完全同步。
將PCR反應第壹個15循環的熒光信號作為熒光背景信號,默認設置熒光閾值為3-15循環熒光信號標準差的10倍,即閾值= 10 * sdcycle3-15。
使用已知初始拷貝數的標準品可以制作標準曲線,其中橫坐標代表初始拷貝數的對數,縱坐標代表Ct值。因此,只要獲得未知樣本的Ct值,就可以從標準曲線計算出樣本的初始拷貝數。
參考資料:
百度百科-實時熒光定量
百度百科-標準曲線