a.采集標本，壹般為泌尿生殖試子或刷片，少數取前列腺液，精液、關節液，或取輸卵管，直腸活檢物，近年來用初段尿標本離心物，以取代尿道拭子。拭子取材時，將拭子插入男性尿道2-4cm，用力擦取。該方法容易造成尿道損傷及繼發感染。用時須慎重。女性則需先清潔宮頸鱗狀與柱狀上皮結合部，用細胞刷收集宮頸標本，能增加感染細胞的數量，較棉拭子敏感性高。
b.常用培養基為牛心浸液或蛋白腖，並含1%新鮮酵母浸液，10-20%動物血清及0.5%氯化鈉，還可加葡萄糖和精氨酸以促進MH和MG生長，加入尿素以供UU代謝，適量加青黴素抑制雜菌。
2.血清學鑒定法：最常用的是瓊脂擴散法，即將支原體接種到瓊脂皿上。然後再用浸過適量血清的濾紙放到瓊脂表面，觀察哪壹種能抑制支原體生長。也可用瓊脂表面的菌落作熒光抗體染色法，用落射熒光顯微鏡觀察，此法的優點是可以利用最初生長在瓊脂表面上的菌落而不必將支原體傳代。
血清學診斷試驗：酶聯免疫吸附試驗（ELISA）敏感性高：微量免疫熒光法（MIF）具有快速特點。
3.基因診斷：利用DNA探針對支原體診斷其敏感性稍差，但特異性高，用聚合酶鏈反應（PCR），敏感性