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如何提升crispr效率

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大多數植物基因組編輯研究利用來自化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的CRISPR-Cas9系統(SpCas9)。spCas9的識別依賴於特定的PAM序列NGG,這大大限制了該系統的編輯位點選擇範圍。為了解決這個問題,研究人員們從不同方向入手,尋找解決的辦法。

2016年3月,中國水稻研究所王克劍課題組的研究人員通過對Cas9蛋白進行定點突變,獲得了Cas9蛋白的VQR變體,並在水稻基因組中成功實現對NGA鄰近序列的編輯,極大的擴展了基因編輯位點的選擇範圍(Hu et al.,2016)。然而CRISPR-Cas9-VQR系統與原CRISPR-Cas9系統相比較,其編輯效率依然偏低,這限制了該系統在水稻中的推廣應用。

2017年6月12日,王克劍團隊與中科院遺傳與發育生物學研究李家洋團隊合作,在Plant Biotechnology Journal發表了題為“Increasing the efficiency of?CRISPR-Cas9-VQR precise genome editing in rice”的文章( Hu et al.,2018),通過優化sgRNA的結構以及使用水稻內源性強啟動子來驅動Cas9及VQR變體的表達,顯著提高了CRISPR-Cas9及CRISPR-Cas9-VQR系統在水稻中的基因組編輯效率。通過試驗,水稻中的編輯效率最高可達到近80%,提升幅度最高可達8倍。於此同時,該系統可以通過同位酶連接方式串聯多個sgRNA同時進行多位點編輯(構建方法可參考王克劍團隊王春博士2015年發表在Journal of Genetics and Genomics上的文章; Wang et al.,2015)。在多位點編輯時,效率提升幅度更加明顯,可以達到15倍。因此,修飾後的CRISPR-Cas9-VQR系統將成為多NGA靶標位點編輯的強大工具。

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