我想分享壹篇2020年2月6日發在《Cell》的paper，“ Co-incidence of Damage and Microbial Patterns Controls Localized Immune Responses in Roots ”，壹作是來自瑞士洛桑大學的周峰博士，碩博期間就特別優秀，師從萬建民院士，克隆了水稻中抑制獨腳金內脂激素信號的基因DWARF53，並對其功能進行了研究，調控矮化和多分蘗，相關工作發在《Nature》上，現已全職回國。我覺得本篇的亮點在於，壹，創造性地采用壹種新型的報告系統和細胞消融技術。二，借單細胞測序的東風，在單細胞水平完成植物根系對天然免疫響應的時空變化。三，機制擴充到多種PRR。四，根與根際有益(害)微生物。
文章回答了這樣壹個問題：擬南芥根系在面臨損傷和病原菌侵染時，在單細胞水平如何激活下遊的免疫響應。
對植物免疫響應來說，識別病原菌聯系的分子模式(MAMPs)是至關重要的。這種復雜的感知系統不斷地暴露在微生物群組中，如何有效地應用於根系仍然是個謎。通過觀察擬南芥根系在細胞水平上MAMP受體的表達模式和響應水平，我們觀察到，已分化細胞的外層展示了低水平的PRR(pattern-recognition receptors)表達，並且缺乏下遊的MAMP響應。然而，這些細胞可以通過鄰近細胞的損傷而產生反應。小細胞簇的激光消融能強烈地上調其鄰近細胞的PRR表達，並且提高的PRR水平足夠引起非響應細胞的免疫反應。最後，局部損傷也會導致對非免疫原性有益菌的免疫反應。損傷門控被受體過表達所覆蓋，從而使病原菌無法在根際定植。我們的研究發現，細胞損傷可以“開啟”局部免疫反應，這有助於理解細胞損傷是如何發生的，盡管土壤中存在微生物模式，但可以利用MAMP感知。
背景就簡單介紹壹下。如PTI的標誌過程，如ROS的累積，MAPK的激活，其他Marker基因的表達。
材料：triple mVENUS fused to a nuclear localization signal (NLS-3xmVENUS)，熒光marker材料，可以在體內且在細胞水平分析MAMP的響應，
MAMP響應的marker基因：1.PER5 (PEROXIDASE 5)，受早期的MAMP誘導，且在根中高表達；2.WRKY11 (WRKY DNA-BINDING PROTEIN 11)；3.MYB51(MYB DOMAIN PROTEIN 51)；4.FRK1 (FLG22-INDUCED RECEPTOR-LIKE KINASE 1)。
flg22-Induced MAMP Responses Are Spatially Restricted in Arabidopsis Roots
從圖1的ABC可得，四種marker基因中，在經過flg22處理根部後，PER5和FRK1背景噪音較低、誘導性較好，且MAMP響應的位置局限在分生區和伸長區。對於已分化的根部分，即使用高濃度的flg22處理，也不能觀察到MAMP的響應信號。（紅色是PI染色，綠色是熒光信號）
為了準確評估特定細胞和細胞類型的信號，作者產生了兩種marker的遺傳材料，另外壹種是組成型表達且靶向質膜的RFP。作者在長期觀察中發現，使用flag22處理後，在已分化的根中展示出減弱的，空間限制的MAMP響應，而在側根形成過程中，側根原基附近的細胞由於側根原基的頂出遭到了破壞，此時施加flg22，側根原基鄰近細胞展示出對MAMP處理較強的響應（1D，1F，藍色箭頭表示側根原基形成點，虛線圈表示側根原基的形成，白色箭頭表示MAMP響應）並且，當有自發的、非誘導性的細胞死亡時(1E*位置)，在鄰近的細胞發現了flg22誘導的MAMP響應，並且這種響應是與受體(FLS2)有關的(1G)。因此，已分化的根有能力對MAMPs作出反應，這種反應被壹種高度局部化的方式(側根原基形成，自發性細胞死亡)誘導。
Laser-Induced Cell Ablation Causes Localized MAMP Responsiveness in Roots
(F2A白色星號代表激光消融的細胞，均在已分化的根操作,EP表皮,Co皮層,En內皮層,St中柱細胞)
使用激光消融破壞了不同類型的根部細胞後，我們只在鄰近細胞觀察到了強烈的flg22響應增加。而對於被消融的細胞本身，導致了沒有或極少的MAMP marker基因的誘導，揭示了本身的細胞破壞並不足以去引起強有力的MAMP的響應。在表皮，皮層和內皮層都被消融後，中柱細胞較強地響應flag22的誘導，然而表皮細胞的消融並不會造成其表皮鄰近細胞對flag22的響應(F2AB)。
早先我們知道，土壤中的有益微生物會定植在跟的伸長區，使用高劑量(1um)的flg22處理伸長區(F1B)也就模擬了這種過程，不需要damage就能造成MAMP響應。為了排除劑量效應，我們想知道低劑量(100nm)的flg22配合細胞消融，會不會在鄰近細胞造成MAMP響應。我們發現，在施用100nm的flag22處理後，在無損傷的伸長區只看到了少量的MAMP誘導響應(F2CD)，但是如果破壞伸長區的表皮細胞，其皮層細胞的MAMP響應加強，這壹點與已分化的根相似(F2ABCD)。因此作者推測，損傷誘導的鄰近細胞MAMP響應的增強可能發生在整個根部。
Presence of DAMPs Alone Are Not Suffificient to Induce MAMP Responses
到這裏，作者想，會不會是cell damage產生的DAMPs引起了鄰近細胞的MAMP響應。於是作者選取了幾種經典的DAMPs，如AtPEP1,ATP,Cellobiose,OGs,以及被cocktail處理過的上述四種DAMPs的混合物。每種DAMPs分別與flg22混合後處理發現，即使使用高濃度的DAMPs也不能誘導強烈和持續的flag22響應。[EZ出現熒光是因為高濃度(1um)flag22處理會引起MAMP響應，不需要cell damage].AtPEP1是個例外，只能引起DZ區微弱的FRK1響應，而不是PER5響應。這就說明，鄰近細胞感知damage信號比作者想象的要復雜，並不是通過DAMPs，可能通過離子和滲透物的釋放或其他的機械壓力。
MAMP Receptor Expression Is Induced by Cell Ablation and Is Suffificient to Induce Responsiveness
作者發現，在FLS2過表達材料中，施用flg22處理能在已分化的外部根細胞層觀察到flg22的響應(F4A)，這也就暗示cell damage引起的鄰近細胞MAMP響應是否和PRR表達量升高有關。
我們發現，不管在根的成熟區還是伸長區，FLS2的轉錄水平在受到損傷的時候被激活(F4,BDFG)。並且FLS2在時間和空間的上調程度與觀察到的MAMP(FRK1和PER5)的響應模式壹致(F2ABCD與F4BCDF對比)。從F4E中，在受到cell damage和施加flag22後，我們發現FLS2的局部表達水平升高。作者想知道是否FLS2的激活和MAMP響應有關，發現在用相同flag22和cell damage處理的情況下，鄰近MAMP響應的細胞和FLS2激活的細胞壹致(F4HI)。這也就說明，cell damage誘導了PRR的高表達，並且足夠去引起MAMP響應。
Casparian Strips Compartmentalize flg22 Responses in Differentiated Roots
(sgn3-3凱氏帶缺失突變體，外界物質可直接進入中柱鞘細胞。F5AB均為已分化的區域)
FLS2在中柱鞘細胞高表達，但在sgn3-3的成熟區，施加flg22沒有觀察到flg22的響應，但是在過表達FLS2材料中，施加flg22，在sgn3-3中觀察到了flg22響應，野生型中卻沒有(F5AB,紅色箭頭處表示中柱鞘細胞，由於凱氏帶的阻擋，PI並不能對其染色)。這個結果說明凱氏帶能夠區室化免疫感知。在WT中，FLS2的量並不能夠引起MAMP的響應，但是強啟動子卻可以(F5.AB 3rd column)。
Suberin Lamellae Interfere with flg22 Perception in the Endodermis
sgn3:凱氏帶在延伸起始後25細胞期不連續
esb1:凱氏帶在延伸起始後25細胞期不連續，內胚層提前栓質化。
ABA-treated:內胚層提前栓質化。
凱氏帶功能是阻止外部物質進入中柱細胞，而內栓層(壹種次級細胞壁修飾)，最終圍繞在整個內胚層並且抑制了內胚層的分子吸收，因為疏水性的內栓層不允許來自細胞壁的分子進入內皮層的細胞膜(F5,CD)。
我們發現早期分化的內皮層(開始延伸後的25細胞期，沒有栓化)在FLS2過表達材料中表現出對flg22的響應，但在後期內皮層細胞(開始延伸後的55細胞期，栓化)沒有表現出對flg22的響應。(F.5E,2nd column)在esb1和ABA-treated中，flg22的響應在早期的內胚層被抑制，展示出細胞保護性的提前栓質化使得FLS2無法與flg22結合(F.5E)。即使是在根部成熟區，破壞表皮和皮層，這種現象(內胚層提前栓化導致的FLS2與flg22隔絕)(F.5F)也同樣發生。
Cell Damage Activates Expression of Multiple Pattern Recognition Receptors
做完壹個受體的機制後，作者就想把機制擴大，接下來找到了三種PRR，EFR,CERK1,RLP23.作者觀察到，在cell damage情況下，這三種受體的都出現上調表達，這就揭示了cell damage介導了壹種十分普遍的應對MAMPs時的上調響應。(F6AB)
做完經典的LRR domain的受體，作者又想在非經典的受體上是否還適用呢，如LORE(LIPOOLIGOSACCHARIDE-SPECIFIC REDUCED ELICITATION)。相似的是，在早期分化的細胞被破壞後，LORE的表達也被強烈誘導，並且施加其配體也主導了在伸長區MAMP的響應，而不是在成熟區，這壹點與flg22相似(F6D)。這就把這條機制延伸到了其他PRR.
Local Gating of Immune Responses by Damage in Root-Bacteria Interactions
剛剛都是細胞學試驗，最終還是要落實到實際情況上。使用有益菌(CHA0)進行根部侵染，作者觀察到，盡管在根部有較強的定植，但在沒有受到破壞的已分化根部沒有觀察到MAMP響應，與細胞學試驗類似的是，在側根原基形成的鄰近細胞(自發破壞)觀察到了MAMP響應，過表達FLS2並不需要cell damage就能引起MAMP響應(F7A)。當細菌侵染與細胞消融結合起來時，鄰近破壞位點的細胞在有細菌存在時展示出對MAMP的響應(F7BC)。細菌提供了各種ligand
作者接下來使用對根際有害的菌,GMI1000，GMI1000最初的侵染並不會造成細胞破壞和強烈的MAMP響應，但是繼續侵染會造成壹些表皮細胞死亡，這個時候就能在鄰近細胞觀察到局部的MAMP響應升高(F7D)。在FLS2過表達材料的成熟區中，不管用flg22處理(F4A)還是有益菌侵染(F7A)都展示出MAMP響應和低的菌生長量(F7A,E)。這裏有意思的是，有害菌GMI1000的flagellin並不能激活擬南芥的FLS2受體。
作者提出的模式圖見F7F，就不贅述了。
Inspiration for me
1.把試驗做細，大框架已經建好，細節見成敗。
2.多做近似相等，比如，A=B,B=C,那麽A=C。
3.每壹步試驗都需要做，不能偷懶且想當然，畢竟生物體這麽復雜~