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?植物組織培養及其在中草藥研究中的應用

植物組織培養(植物?紙巾?Culture)是用無菌培養的方法培養的植物的體外部分,即把從自然環境中分離出來的植物細胞或組織放入裝有合成培養基的瓶中,使其在無菌條件下生長或發育的方法。這項工作自20世紀50年代末以來取得了很大進展。如誘導胡蘿蔔體細胞分化成完整植株,曼陀羅花藥培養形成單倍體植株。

因此,證明了植物的每個體細胞都具有形成完整植株的潛力。例如,植物細胞是全能性的,並且可以在體外培養的某些條件下誘導它們分化器官和再生植物。20世紀70年代以後,植物原生質體培養和體細胞雜交的研究有了很大發展。例如,煙草、曼陀羅、顛茄、胡蘿蔔和油菜可以從它們的原生質體再生並分化成胚或完整植株。煙草屬和矮牽牛屬的雜種細胞可以通過原生質體融合增殖並分化成雜種植株。

因此,利用組織培養方法,可以在相對簡單、易於觀察的條件下,研究細胞、組織或器官的繁殖、生長和分化以及各種外界因素對其的影響,從而為解決農業生產和藥物生產中的壹些問題開辟了廣闊的前景。目前,已有幾項重要成果應用於生產實踐。壹種是無性繁殖系的快速繁殖,如甘蔗,以前每畝用甘蔗種子0.5 ~ 1噸。再比如貝母的繁殖率很低,組織培養分化出來的鱗莖大約三個月,相當於種子繁殖的二年生鱗莖。另壹個是藥物和生物制品的工業化生產。藥用植物的有效成分壹般是從植物中提取的,其產量和質量不可避免地受到植物遺傳、生長條件、采收期、貯運等因素的影響。如果能通過類似培養微生物生產抗生素的方法生產有效成分,就能克服這些缺點。例如,近年來,大量培養人參組織並提取有效成分。因此,利用組織培養生產藥用成分,探索天然藥物生產的產業化道路,是藥物生產的新方向。隨著大規模人工培養技術的成功,用組織培養代替全草提取有效成分成為可能,這將是未來植物藥物研究的中心課題之壹。

壹、培養基的組成和制備方法

近年來使用的化學合成培養基由六種成分組成:(1)糖類,兩種以上無機鹽,(3)微量元素,(4)氨基酸、酰胺和嘌呤,(5)維生素,(5)維生素。3生長素。此外,有些培養基還可以添加天然果汁,如椰奶、酵母提取物、水解酪蛋白、麥芽提取物等。如果培養基中添加0.5 ~ 1%瓊脂,則為靜態培養的固體培養基,否則為懸浮培養的液體培養基。不同的植物材料往往需要改變配方,如維持生長、誘導細胞分裂分化等,因此配方種類繁多。目前,Ms?(村重?然後呢。Skoog)培養基配方是最常用的基礎培養基,有利於壹般植物組織和細胞的快速生長。

簡而言之,培養基的組成應根據研究目的和培養植物的類型來確定。除了營養和誘導,還要註意離子平衡和毒性。比如水壹般用蒸餾水,無機鹽壹般用化學純藥物。pH值可以是1N嗎?KoH(或NaOH)溶液和2N?HCI調整。有時可以用普通藥物代替,但要註意這些藥物不僅要有營養價值,還要無毒。如果在工業上用大罐培養細胞或組織來生產有效成分和生物制品,培養基的用量會用噸位來衡量,那麽用什麽替代品更經濟實用就要慎重考慮了。

第二,文化條件

(1)溫度:對大多數植物組織來說,20 ~ 28℃就能滿足生長需要,26 ~ 27℃最適宜。

(2)光照:組織培養通常在散射光下進行。光線的影響會導致不同的結果。壹些植物組織在黑暗中長得更好,而另壹些在光照下長得更好。而愈傷組織分化成器官時,每天需要壹定的光照才能形成芽和根。壹些次要物質的形成僅由三個因素決定。

(3)滲透壓:滲透壓與植物組織的生長和分化密切相關。滲透壓可以通過向培養基中加入鹽、蔗糖、甘露醇和乙二醇來調節。壹般1 ~ 2大氣壓能促進植物組織的生長。當大氣壓在2以上時,生長障礙出現,植物組織在6個大氣壓下無法存活。

(4) pH值:壹般植物組織生長最適宜的pH值為5 ~ 6.5。在培養過程中,可以改變pH值,添加磷酸氫鹽或二氫鹽可以起到穩定作用。

(5)通風:懸浮培養中細胞的旺盛生長必須有良好的通風條件。少量懸浮培養時,經常旋轉或振蕩,可以起到通氣攪拌的作用。在大量培養中可以使用特殊的通氣和攪拌裝置。

三。材料和方法

從低等藻類到高等植物如苔蘚、蕨類和種子植物的所有種類和部位都可以作為組織培養材料。壹般裸子植物利用幼苗、芽和韌皮部細胞,被子植物利用胚、胚乳、子葉、幼苗、莖尖、根、莖、葉、花藥、花粉、子房和胚珠。

因為在自然條件下,植物表面經常受到黴菌和細菌的汙染,所以必須對材料進行消毒。壹般使用漂白粉溶液(1 ~ 10%)、次氯酸鈉溶液(0.5 ~ 10%)、氯化汞溶液(0.01%)、乙醇(70%)或雙氧水(3 ~ 10%)。在合適的條件下,壹種去分化的組織塊,稱為愈傷組織,可以很快在受傷組織切口的表面生長,在合適的培養基上經過壹定時間後,可以誘導生長成完整的植株。因此,愈傷組織不僅是某些植物代謝產物的來源,也是誘導植物的主要途徑之壹。

在適宜的培養條件下,愈傷組織可以長期繼代培養,稱為繼代培養。但在繼代培養中,隨著繼代代數的增加,許多植物組織或細胞的分化能力逐漸降低甚至喪失,這可能是由於培養過程中原始基質中與器官形成有關的特殊物質逐漸消耗所致,因此可以通過激素或改善營養條件來恢復。有人認為是組織和細胞在長期培養中的遺傳性變化,主要是染色體的變化,出現大量多倍體或非整倍體細胞,有可能恢復。不同的培養基可以使愈傷組織有不同的生長速度,結構可以是松散的,也可以是緊密的。利用這些特性,它可以分散成單個細胞或小細胞團。要形成單細胞,要在高鹽、高生長素、高水解酪蛋白的培養基中進行培養,然後移入液體中,通過攪拌分散成單細胞。加壹些果膠酶也是有用的,但壹般來說,很少能得到純的單細胞。

在選擇培育藥用植物的材料時,還要考慮所需次生物質在植物中的合成部位。如果材料和培養方法適當,原植物中產生的主要代謝產物可以通過細胞或組織培養進行生化轉化獲得。

通過組織培養可以獲得有效成分,但實際上只有大量成功培養才有經濟價值。因此,生產中常采用懸浮培養代替含瓊脂的固體培養基。懸浮培養的愈傷組織生長速度通常比靜止培養快,這是因為營養物質可以更快地滲入細胞,抑制生長的代謝廢物可以更快地被清除,供氧也更好。在此培養過程中,應註意通風和定期更新營養液,這是保證穩定生長和高次級生物量產量的關鍵之壹。

第四,有效成分的形成

列舉了壹些通過組織培養合成的有效成分。

利用組織培養生產藥用成分逐漸成為藥物生產的新方向之壹。自20世紀60年代以來,壹些國家對盾葉薯蕷等相關科屬進行組織培養,研究薯蕷皂苷元的形成,探索其生物合成機制。已知有7種薯蕷屬植物經過組織培養後可以獲得薯蕷皂苷元或其他甾體化合物,其中有地錦?德爾托伊德斯?Wal1 .組織培養得到的薯蕷皂苷元含量為0.3 ~ 2.5%,此外還有魚藤酮、甘草甜素、煙堿等。例如,通過煙草根尖細胞的懸浮培養可以產生2.9%(幹重)的尼古丁。

在常用的基礎培養基中添加生長激素、維生素或其他化學物質,有時可以增加代謝產物。例如,曼陀羅組織培養時,在培養基中添加0.1%酪氨酸,可使阿托品產量提高7倍以上,蕓香屬組織培養時,在培養基中添加4-羥基-2-奎寧,可促進白鮮堿的合成和積累。在這兩種情況下,添加劑被認為是生物合成的前體。再如愈傷組織培養時生長後期補充1my/1激動素,東莨菪堿含量可達0.495%,遠高於原植株。

除了培養基的成分,環境因素也影響次生物質的產生。比如芹菜的組織培養雖然在黑暗中增殖,但不形成黃酮類物質,但在光照下,可以檢測到芹菜素。組織培養應用於藥學的歷史雖然不長,但發展很快。它具有以下優點:

1.用組織培養代替原有的植物栽培來獲得所需的有效成分,達到高產低成本的目的,節約土地。

2.它不僅可用於生產二次生物質,還可用於生物轉化。例如,在煙草組織培養中,蒂巴因脫甲基後可產生嗎啡。

3.從組織培養的定性分析中發現了新的化合物。例如,在蕓香屬的組織培養中,合成並積累了蕓香素,這是壹種從原植物或其他植物中未檢測到的化合物。因此,組織培養將成為獲得新的生物活性化合物的來源。

4.壹般來說,組織培養是異養的,但也有自養的細胞系,具有光合作用的能力,不依賴外界的糖供應。這壹特點將使細胞培養技術優於整株,更經濟。

目前,我國有關單位已成功產業化了麥角菌、靈芝、猴頭菇等真菌,高等植物組織培養在產業化中的應用也在研究中。

總之,植物組織培養在中草藥中的應用前景是無限的,不僅有利於探討和闡明藥用植物的生理、遺傳、成分生物合成等壹系列理論問題,而且壹旦工業化生產問題得到解決,將為疾病的預防和治療做出巨大貢獻。

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