外植體的選擇(1)壹般來說,組織培養中的外植體可分為兩類:壹類是帶芽的外植體,如莖尖、側芽、鱗芽、原球莖等。,可在組織培養過程中直接誘導和促進叢生芽的產生,獲得再生植株的成功率高,變異性小,易於保持材料的優良性狀。另壹類主要是根、葉等營養器官和花藥、花瓣、花托、胚珠、果實等生殖器官。這些外植體大多需要壹個脫分化過程,在愈傷組織階段後分化成芽或胚狀體,然後形成再生植株。
在快速繁殖中,最常用的外植體是莖尖。通常切口在0.5 cm左右,太小,產生愈傷組織的能力弱;如果太大,它會在培養容器中占據太多的空間。如果用外植體培養脫毒苗,通常只取莖尖的分生組織部分,其長度通常在0.1 mm以下。
(2)外植體的消毒由於大部分外植體使用的是從外部生長的植物,所以往往會攜帶各種微生物。如果把它們帶入培養基中,它們會迅速繁殖,形成汙染,導致培養失敗。因此,外植體的消毒是壹項必不可少的工作。消毒既要殺死外植體上的病菌,又要損傷材料,影響其生長。由於不同的材料、不同的培養條件和季節,不同的外植體應采用各自適宜的消毒劑種類、消毒劑濃度、消毒時間和處理程序進行消毒。
理想的消毒劑應具有較強的殺菌能力,且應易於去除,不易損傷外植體。常用的有次氯酸鈉(0.5% ~ 10%)和漂白粉(1% ~ 10%)濾液,能分解產生具有殺菌作用的氯氣,自行散發到空氣中。只要濃度合適,壹般不會傷害外植體。雙氧水(3% ~ 10%)也容易分解,不易損傷外植體。酒精(70%)滲透力強,有殺菌作用,易揮發,但會殺死組織和細胞,所以消毒時間不宜過長。常用酒精先消毒幾秒鐘,有利於其他消毒劑滲透到材料中發揮殺菌作用。
消毒方法和程序因不同的材料而異。通常用酒精(70%)浸泡數秒,取出後用10%次氯酸鈣飽和上清液浸泡10 ~ 20分鐘或2% ~ 10%次氯酸鈉溶液浸泡6 ~ 15分鐘,然後用無菌水沖洗三次。
2.外植體的增殖
外植體的增殖是組織培養的關鍵階段。接種後,培養容器在培養室。壹般每天光照16小時,1500 ~ 3000勒克斯,溫度25℃左右進行分化培養。為了擴大新芽形成後的繁殖系數,需要進行繼代培養。將材料分成植株或切片轉移到增殖培養基中,增殖培養基壹般在分化培養基上改良,以提高增殖率。經過1個月的增殖培養後,可根據情況重新增殖,繼代後可增加植株數。
繼代培養中,由於外植體本身來自無菌環境,不需要消毒,操作方便。但繼代培養中外植體的分化能力會逐漸降低,所以繼代代數不是無窮無盡的。
3.根誘導
繼代培養形成的不定芽和側芽壹般沒有根,必須轉移到生根培養基上進行生根培養。生根培養基多為1/2MS培養基,因為降低無機鹽濃度有利於根的分化。此外,生根培養基與增殖培養基在激素的種類和濃度上有很大不同,如細胞分裂素和生長素等。壹般來說,細胞分裂素抑制生根,而生長素促進生根。
壹般在生根培養基中培養1個月左右即可獲得壯根。此外,生產中也有試管苗具有根原基,即只在生根培養基中培養7 ~ 10天,誘導出根原基或小於1 mm的幼根後再用於移栽,由於基部切口已愈合形成根原基,不易被侵染,定植後生根快,成活率高。
4.組培苗的煉苗和移栽
生根或形成根原基的試管苗從無菌、穩定的光、溫、濕環境進入自然環境,從異養向自養的轉變過程,必須經過壹個馴化鍛煉過程,這就是煉苗。
壹般在移栽前,打開培養容器的蓋子,在室內自然光下放置3天,然後取出幼苗,用自來水沖洗根部的瓊脂,再種入準備好的基質中。基質通常是泥炭、珍珠巖、蛭石、米糠灰等。或者適當添加壹些園土,使用前最好用高溫或藥物消毒。移栽前期要適當遮蔭,加強水分管理,保持較高的空氣濕度(相對濕度90%左右)。但註意基質不宜過濕,不要積水,以防爛苗。此外,溫度對存活率也有很大影響,最適溫度為15 ~ 25℃。夏天溫度過高,水分少的時候幼苗容易枯萎,水分多了容易腐爛,管理難度大,成活率下降。經過4 ~ 6周的煉苗,待新梢開始生長後,即可轉入正常管理。