大豆分離蛋白，由鄭州同創益生食品有限公司提供；堿性蛋白酶（2.4AU/g）、風味復合酶（500LAPU/g）、復合酶（1.5AU/g），由Novozyme提供；木瓜蛋白酶（60萬u/g），由廣西南寧傑沃生物制品有限公司提供；菠蘿蛋白酶（2500GDU），由廣州豐天化工有限公司提供；胃蛋白酶（1∶10000）、胰蛋白酶（250.U.F.U/mg）、亞油酸（分析純），由Sigma提供；磷酸緩沖液（pH9.35）、FeCl2-EDTA溶液（0.05mol/L）、FeCl2溶液（0.1mol/L）、KSCN（40%）、乙醇（75%，含0.3mol/L HCl）、茚三酮顯色試劑、甘氨酸溶液（含氮量5ug/ml）、1mol/LNaOH溶液、2N HCL溶液等。
1.2 儀器
紫外可見分光光度計，超聲波清洗機，離心分離機，pH酸度計，凱氏定氮儀，增力電動攪拌器，電熱恒溫水浴鍋，恒溫幹燥箱。
1.3 實驗方法
1.3.1 氮含量測定
凱式定氮（GB/T5009.5-2003）。
1.3.2 大豆肽溶液制備
配制4%（W/V）的大豆蛋白溶液，迅速加熱至80℃，經80℃水浴保溫熱處理10min後冷卻至酶最佳水解溫度，保持溫度和攪拌速度不變，同時用NaOH（HCl）標準溶液調節溶液pH值至酶解最佳pH值。按比例稱取蛋白酶加到大豆蛋白溶液中，開始計時，在反應過程中及時加入NaOH（HCl）標準溶液維持pH值不變，到預定的反應時間提取壹定體積的溶液，然後迅速升溫到85℃滅酶活10min，冷卻後，以5000r/min離心分離10min，取其上清液測定水解度和抗氧化值。
1.3.3 水解度測定［4］
h=（A×10-3×10）/（14×0.1）=A/14（mmol/ml）
ho=4%×7.75=0.312 （mmol/ml）
DH（%）=h/ho=23A （1）
註：h:大豆肽溶液中-NH2的濃度（mmol/ml）
ho：蛋白質溶液肽鍵當量濃度（mmol/ml）
A：大豆肽溶液氮濃度（ug/ml）
1.3.4 蛋白酶水解參數的確定
影響蛋白酶水解速度和蛋白質水解度的參數主要有溫度、pH值、底物濃度、酶濃度、時間。以水解度為指標，先用單因素試驗確定參數的最佳值，然後用正交試驗優化因素組合，從而確定蛋白酶水解參數。
1.3.5 大豆肽抗氧化值測定［5］
大豆肽抗氧化值測定參考文獻［5］，並作了適當修改：
在小錐形瓶內放入10ml亞油酸儲備液，300ml0.05mol/L的FeCl2-EDTA溶液，500ul大豆肽溶液，混勻在暗處50℃保存4h，然後取出1000ul，加入200u10.1mol/L的FeCl2溶液，再加入1000ul的40%KSCN溶液，混勻後取出130ul放入幹試管中，再加入6ml乙醇（75%，含0.3mol/L HCl），混勻後反應5min，再測定該混合液481nm下的吸光值。以未水解的大豆蛋白反應溶液的吸光值作為空白值，它的相對抗氧化值為1。
相對抗氧化值=未水解蛋白溶液的吸光值/大豆肽溶液吸光值
2 實驗結果
2.1 含氮量標準曲線
用分光光度計（580nm）測得不同濃度甘氨酸工作液的吸光值見圖1。
含氮量與吸光值的回歸方程為：
y=1.3342x+0.0133 （2），
回歸系數為R2=0.998。
方程（2）的反函數為x=0.425y-0.0095（3），
把方程（3）中的x值代入公式（1）中的A值得
DH（%）=0.17y （4）。
2.2 蛋白酶酶解參數的確定
以水解度為指標，先用單因素試驗確定參數的範圍值（限於篇幅，具體數據略），然有用正交試驗優化因素組合，7種蛋白酶的最佳參數組合見表1。
表1 7種蛋白酶水解參數的最佳組合
溫度（℃） pH值 底物濃度（%） 酶濃度（%） 時間（min）
堿性酶 60 8.0 3 0.5 60
風味酶 50 7.0 4 6 30
復合酶 45 7.0 4 6 20
木瓜酶 55 7.5 5 3 40
菠蘿酶 65 8.0 5 6 30
胃酶 37 2.5 4 2 30
胰酶 50 7.0 5 3 302.3 大豆肽溶液的水解度
2.3.1 大豆肽溶液的吸光度值
用分光光度計（580nm）測得不同蛋白酶水解的不同濃度大豆肽溶液的吸光度值見表2，未水解的蛋白質溶液吸光度值為0.178。
2.3.2 大豆肽溶液的水解度
把表2中的吸光度值代入公式（4）得到相應的大豆肽溶液水解度，結果見圖2，其中未經蛋白酶水解的大豆蛋白溶液的水解度為3.03%。
由圖2可知，7種蛋白酶水解大豆蛋白的程度隨著水解時間（4h內）的延長而增大，但是水解速率開始較大，後來漸漸變的越來越小。其中堿性蛋白酶比其它6種蛋白酶的水解能力明顯強。
2.5 大豆肽溶液的抗氧化值
亞油酸緩沖液與大豆肽混合溶液經抗氧化實驗後，用分光光度計在481nm下測吸光值，再計算大豆肽溶液的相對過氧化值，以相對過氧化值的大小來表示大豆肽的抗氧化能力，結果見圖3。
表2 不同蛋白酶水解產物大豆肽溶液的吸光值
吸光值
1（1h） 2（2h） 3（3h） 4（4h）
堿性酶 0.605 0.705 0.975 0.985
風味酶 0.545 0.632 0.877 0.909
復合酶 0.487 0.532 0.587 0.627
木瓜酶 0.340 0.349 0.355 0.412
菠蘿酶 0.422 0.474 0.708 0.808
胃酶 0.231 0.243 0.293 0.299
胰酶 0.462 0.583 0.599 0.603由圖3可知，蛋白酶所水解的大豆肽溶液的抗氧化力隨酶解時間（4h內）的延長，開始增加較快，後來增加緩慢，有的甚至停止。這7種酶中，堿性蛋白酶所水解的大豆肽溶液抗氧化值最大。
3 結論
（1）大豆肽具有抗氧化性，不同的蛋白酶所制備的大豆肽其抗氧化能力也不相同。
（2）在所研究的7種蛋白酶中堿性蛋白酶的水解能力最強和其所制備的大豆肽抗氧化值最大，應為最佳酶選。◇參考文獻
［1］Chen H M，Muramoto K.Y，amauchi F， etal. Antioxidative properties of histidine containing peptides desinned from peptide frangments found in the digests of asoybean protein .J. Agric. Food. Chem，1998，46:49-53.
［2］張學忠.大豆肽加工技術原理與應用.北京：科學技術文獻出版社，1999：181-200.
［3］陳美珍.大豆分離蛋自酶解物清除羥自由基用的研究.食品科學，2002，23（1）；43-47.
［4］何照範，張迪清.保健食品化學及其檢測技術.北京：中國輕工業出版社.
［5］Adler-Nissen J. Enzymic hydrolysis of food proteins. Elsevier Applied Science Publishers. New York，1986：74-78.
*項目資助：河南省重點科技攻關計劃項目（0523011700）。
作者簡介：黃紀念（1971～ ），男，河南汝南人，博士，副研究員，研究方向為農產品精深加工與功能食品開發。