預固定問題
做科研或臨床時，可能很多FLOWER習慣性都會用4％多聚甲醛預先固定標本，可能出於三個目的： （1）為了滅活標本裏面可能存在的微生物（細菌、病毒等），起到安全保障作用。 （2）希望標本能夠較長時間存放。 （3）做胞內染色前的準備。 但是，可能很多人忽視了壹點，就是如果在染色之前用多聚甲醛固定標本，細胞表面有些位點在固定後構象發生改變，使得抗體無法結合產生假陰性，也可能由於固定作用，導致其它位點產生非特異性結合（假陽性）。
因此，知道哪些抗體染色前不能預固定，十分重要。幸好，我們自己不用做驗證，在Biolegend公司網站[1]，貼心的技術人員已經幫我們做了壹系列測試，下面兩張表，壹張是人類抗原，壹張是小鼠抗原，可以看的出來，大多數不能做預固定的抗體都是趨化因子受體，所以，大家在實驗中千萬要註意不要先固定後染色。
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表1、4％多聚甲醛預固定對各種抗體表面染色的影響（人類），打勾的為允許預固定，打叉的表示預固定影響很大
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表2、4％多聚甲醛預固定對各種抗體表面染色的影響（小鼠），打勾的為允許預固定，打叉的表示預固定影響很大
染色後固定問題
染色後的固定，就與抗原構象關系不大了，更多的是熒光素。以前4色以內的時候，用的熒光素都是非串聯的，因此大多數影響不大，但隨著各種新型串聯染料的出現，多聚甲醛固定就成了問題了。
事實上，當妳去搜索串聯染色標記（如PE-cy7、APC-cy7等）的抗體時，會發現壹些比較詳細的描述裏面會註明（以BD網站搜索APC-cy7各類抗體為例）：
Fixed cells should be analyzed within 4 hours of fixation in paraformaldehyde or transferred to a paraformaldehyde-free buffer for overnight storage.
意思就是用多聚甲醛固定過的樣本，必須在4小時內檢測，否則容易導致串聯染料降解，若要長時間保存，還是需要洗滌後，轉移到不含多聚甲醛的緩沖液中。
需要註意的是，做GFP熒光檢測的同學，也需要註意壹下，多聚甲醛固定也會影響GFP，New York Medical College的Paul A Lucas認為是由於多聚甲醛固定後，並非使GFP熒光淬滅，而是使GFP蛋白構象發生改變，無法產生熒光[2]。有時候妳固定後檢測到的熒光可能是自發熒光，或剩余的未被改變構象的GFP發出的。
解決方案
1、如果檢測的是前述表格中容易被多聚甲醛影響的分子，請盡量不要預固定，如需長期保存樣本，可以考慮凍存單個核細胞。
2、如果檢測的是前述表格中不會受多聚甲醛影響的分子，可用1％多聚甲醛預固定保存，但不能長時間使用，否則對細胞FSC、SSC和熒光強度影響大。此時可考慮使用流式中文網的FlowGuard?細胞保存液[3]，FlowGuard?是國內專利性原研產品，不含多聚甲醛，能緩釋出壹種特殊的弱固定成份，FSC的變化較多聚甲醛輕微，對抗原強度保持更長久，樣本:保存液＝6:1～10:1，21天內檢測結果穩定性好。
3、如果希望在染色後保持24小時左右的熒光穩定，仍首選建議：避光、4度，我們曾經在10色（BV405、KO、FITC、PE、ECD、PE-cy5.5、PE-cy7、APC、APC-A700、APC-cy7）流式方案非正式測試時，曾經測過數例，在避光、4度保存24小時後，熒光強度幾乎無變化，細胞分群良好。 如果仍不放心，可考慮購買商品化的適用於串聯染料的專用保存劑