預固定問題
做科研或臨床時,可能很多FLOWER習慣性都會用4%多聚甲醛預先固定標本,可能出於三個目的: (1)為了滅活標本裏面可能存在的微生物(細菌、病毒等),起到安全保障作用。 (2)希望標本能夠較長時間存放。 (3)做胞內染色前的準備。 但是,可能很多人忽視了壹點,就是如果在染色之前用多聚甲醛固定標本,細胞表面有些位點在固定後構象發生改變,使得抗體無法結合產生假陰性,也可能由於固定作用,導致其它位點產生非特異性結合(假陽性)。
因此,知道哪些抗體染色前不能預固定,十分重要。幸好,我們自己不用做驗證,在Biolegend公司網站[1],貼心的技術人員已經幫我們做了壹系列測試,下面兩張表,壹張是人類抗原,壹張是小鼠抗原,可以看的出來,大多數不能做預固定的抗體都是趨化因子受體,所以,大家在實驗中千萬要註意不要先固定後染色。
圖片
表1、4%多聚甲醛預固定對各種抗體表面染色的影響(人類),打勾的為允許預固定,打叉的表示預固定影響很大
圖片
表2、4%多聚甲醛預固定對各種抗體表面染色的影響(小鼠),打勾的為允許預固定,打叉的表示預固定影響很大
染色後固定問題
染色後的固定,就與抗原構象關系不大了,更多的是熒光素。以前4色以內的時候,用的熒光素都是非串聯的,因此大多數影響不大,但隨著各種新型串聯染料的出現,多聚甲醛固定就成了問題了。
事實上,當妳去搜索串聯染色標記(如PE-cy7、APC-cy7等)的抗體時,會發現壹些比較詳細的描述裏面會註明(以BD網站搜索APC-cy7各類抗體為例):
Fixed cells should be analyzed within 4 hours of fixation in paraformaldehyde or transferred to a paraformaldehyde-free buffer for overnight storage.
意思就是用多聚甲醛固定過的樣本,必須在4小時內檢測,否則容易導致串聯染料降解,若要長時間保存,還是需要洗滌後,轉移到不含多聚甲醛的緩沖液中。
需要註意的是,做GFP熒光檢測的同學,也需要註意壹下,多聚甲醛固定也會影響GFP,New York Medical College的Paul A Lucas認為是由於多聚甲醛固定後,並非使GFP熒光淬滅,而是使GFP蛋白構象發生改變,無法產生熒光[2]。有時候妳固定後檢測到的熒光可能是自發熒光,或剩余的未被改變構象的GFP發出的。
解決方案
1、如果檢測的是前述表格中容易被多聚甲醛影響的分子,請盡量不要預固定,如需長期保存樣本,可以考慮凍存單個核細胞。
2、如果檢測的是前述表格中不會受多聚甲醛影響的分子,可用1%多聚甲醛預固定保存,但不能長時間使用,否則對細胞FSC、SSC和熒光強度影響大。此時可考慮使用流式中文網的FlowGuard?細胞保存液[3],FlowGuard?是國內專利性原研產品,不含多聚甲醛,能緩釋出壹種特殊的弱固定成份,FSC的變化較多聚甲醛輕微,對抗原強度保持更長久,樣本:保存液=6:1~10:1,21天內檢測結果穩定性好。
3、如果希望在染色後保持24小時左右的熒光穩定,仍首選建議:避光、4度,我們曾經在10色(BV405、KO、FITC、PE、ECD、PE-cy5.5、PE-cy7、APC、APC-A700、APC-cy7)流式方案非正式測試時,曾經測過數例,在避光、4度保存24小時後,熒光強度幾乎無變化,細胞分群良好。 如果仍不放心,可考慮購買商品化的適用於串聯染料的專用保存劑