分子標記是繼形態標記、細胞標記和生化標記之後發展起來的壹種較為理想的遺傳標記形式,它以蛋白質、核酸分子的突變為基礎,檢測生物遺傳結構與其變異。分子標記技術從本質上講,都是以檢測生物個體在基因或基因型上所產生的變異來反映生物個體之間的差異。每壹種分子標記都有其自身的特點和特定的應用範圍,但就壹般意義而言,DNA 分子標記與形態標記和生化標記等相比,具有許多獨特的優點: ①不受組織類別、發育階段等影響。植株的任何組織在任何發育時期均可用於分析。②不受環境影響。因為環境只影響基因表達(轉錄與翻譯) ,而不改變基因結構即DNA 的核苷酸序列。③標記數量多,遍及整個基因組。④多態性高,自然存在許多等位變異。⑤有許多標記表現為***顯性,能夠鑒別純合基因型和雜合基因型, 提供完整的遺傳信息。⑥DNA 分子標記技術簡單、快速、易於自動化。⑦提取的DNA 樣品,在適宜條件下可長期保存,這對於進行追溯性或仲裁性鑒定非常有利。因此,DNA 分子標記可以彌補和克服在形態學鑒定及同工酶、蛋白電泳鑒定中的許多缺陷和難題,因而在品種鑒定方面展示了廣闊的應用前景。
1. 1 ?第1 代分子標記
1.1. 1 ?RFLP 標記技術。
1980 年Botesin提出的限制性片段長度多態性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作為遺傳標記,開創了直接應用DNA 多態性的新階段,是最早應用的分子標記技術 。RFLP 是檢測DNA 在限制性內切酶酶切後形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位點的分布情況,因此DNA 序列上的微小變化,甚至1 個核苷酸的變化,也能引起限制性內切酶切點的丟失或產生, 導致酶切片段長度的變化。
優點：RFLP 標記的等位基因具有***顯性的特點,結果穩定可靠,重復性好,特別適應於構建遺傳連鎖圖。
缺點：在進行RFLP 分析時,需要該位點的DNA片段做探針,用放射性同位素及核酸雜交技術,既不安全又不易自動化。另外,RFLP 對DNA 多態性檢出的靈敏度不高,RFLP 連鎖圖上還有很多大的空間區。
1.1. 2 ?RAPD 標記技術。
為了克服RFLP 技術上的缺點,Williams等於1990年建立了隨機擴增多態DNA Randomamplified polymorphic DNA ,RAPD) 技術,由於其獨特的檢測DNA 多態性的方式使得RAPD 技術很快 滲透於基因研究的各個領域。RAPD 是建立於PCR 基礎之上的分子標記技術,基本原理是利用壹個隨機引物(8～10 個堿基) 通過PCR 反應非定點地擴增DNA 片段,然後用凝膠電泳分離擴增片段來進行DNA 多態性研究。對任壹特定引物而言,它在基因組DNA 序列上有其特定的結合位點,壹旦基因組在這些區域發生DNA 片段插入、缺失或堿基突變,就可能導致這些特定結合位點的分布發生變化,從而導致擴增產物的數量和大小發生改變,表現出多態性。
優點：與RFLP 相比,RAPD 技術簡單,檢測速度快,DNA 用量少,實驗設備簡單,不需DNA 探針,設計引物也不需要預先克隆標記或進行序列分析,不依賴於種屬特異性和基因組的結構,合成壹套引物可以用於不同生物基因組分析,用壹個引物就可擴增出許多片段,而且不需要同位素,安全性好。
缺點：當然,RAPD 技術受許多因素影響,實驗的穩定性和重復性差,首先是顯性遺傳,不能識別雜合子位點,這使得遺傳分析相對復雜 ,在基因定位、作連鎖遺傳圖時,會因顯性遮蓋作用而使計算位點間遺傳距離的準確性屬特異性和基因組的結構,合成壹套引物可以用於不同生物基因組分析,用壹個引物就可擴增出許多片段,而且不需要同位素,安全性好。當然,RAPD 技術受許多因素影響,實驗的穩定性和重復性差,首先是顯性遺傳,不能識別雜合子位點,這使得遺傳分析相對復雜 ,在基因定位、作連鎖遺傳圖時,會因顯性遮蓋作用而使計算位點間遺傳距離的準確性下降;其次,RAPD 對反應條件相當敏感,包括模板濃度、Mg2 +濃度,所以實驗的重復性差 。
1. 3 ?AFLP 標記技術
? 擴增片段長度多態技術(AFLP) ,又名限制片段選擇擴增技術(Selective restriction fragment amplifi2cation ,SRFA) ,於1993 年由荷蘭KEYGENE 公司的Zabean 和Vos 等發明,並已申請專利。AFLP 是近年來迅速發展起來的壹種分子標記技術,它將基因組DNA 用成對的限制性內切酶雙酶切後產生的片段用接頭(與酶切位點互補) 連接起來,並通過5′端與接頭互補的半特異性引物擴增得到大量DNA 片段,從而形成指紋圖譜的分子標記技術。AFLP 指紋呈孟德爾式***顯性和顯隱性遺傳。
優點：它兼具RAPD 與RFLP 的優點,有較高的穩定性,用少量的選擇性引物能在較短時間內檢測到大量位點,並且每對引物所檢測到的多個位點都或多或少地隨機分布在多條染色體上,各染色體上AFLP 標記的數目與染色體長度呈正相關( r = 0. 501) ,而壹對引物獲得的標記涉及的染色體數與標記數呈正相關( r = 0. 826) 。因此,通過少量效率高的引物組合,可獲得覆蓋整個基因組的AFLP 標記 。目前,AFLP 作為壹種高效的指紋技術,已在遺傳育種研究中發揮它的優勢。
缺點：不過也有研究認為,AFLP 對基因組純度和反應條件要求較高,另外用於遺傳作圖時,少數的標記與圖譜緊密度有出入。此外, 在RAPD 和RFLP 技術基礎上建立了SCAR(Sequence characterize damplified regions ,序列特異性擴增區域) 、CAPS(Cleaved ampli2fied polymorphic sequence ,酶切擴增多態序列) 和DAF(DNA am2plified fingerprints ,DNA 擴增指紋) 等標記技術 。這些技術的出現,進壹步豐富、完善了第1 代分子標記技術,增加了人們對DNA 多態性的研究手段。
1. 2 ?第2 代分子標記
2. 1 ?SSR 標記技術。
在真核生物基因組中存在許多非編碼的重復序列,如重復單位長度在15～65 個核苷酸的小衛星DNA(Minisatellite DNA) ,重復單位長度在2～6 個核苷酸的微衛星DNA (Microsatellite DNA) 。小衛星和微衛星DNA 分布於整個基因組的不同位點。由於重復單位的大小和序列不同以拷貝數不同,從而構成豐富的長度多態性。Moore 等於1991 年結合PCR 技術創立了SSR (Simple sequence repeat ,簡單重復序列) 標記技術。SSR 也稱微衛星DNA ,是壹類由幾個(多為1～5 個) 堿基組成的基序串聯重復而成的DNA 序列,其中最常見的是雙核苷酸重復,即(CA) n和(TG) n ,每個微衛星DNA 的核心序列結構相同,重復單位數目10～60 個,其高度多態性主要來源於串聯數目的不同。不同遺傳材料重復次數不同,導致了SSR 長度的高度變異性,這壹變異性正是SSR 標記產生的基礎。SSR 標記的基本原理:根據微衛星重復序列兩端的特定短序列設計引物,通過PCR 反應擴增微衛星片段。由於核心序列重復數目不同,因而擴增出不同長度的PCR 產物,這是檢測DNA 多態性的壹種有效方法。微衛星序列在群體中通常具有很高的多態性,而且壹般為***顯性,因此是壹類很好的分子標記。目前已利用微衛星標記構建了人類、小鼠、大鼠、水稻、小麥、玉米等物種的染色體遺傳圖譜。
優點：這些微衛星標記已被廣泛應用於基因定位及克隆、疾病診斷、親緣分析或品種鑒定、農作物育種、進化研究等領域。此外,SSR 標記不僅能夠鑒定純合體和雜合體,而且結果更加可靠,方法簡單,省時省力。
2. 2 ?ISSR 標記技術。
ISSR 即內部簡單重復序列,是壹種新興的分子標記技術。1994 年Zietkiewicz 等對SSR 技術進行了發展,建立了加錨微衛星寡核苷酸(Anchored microsatellite oligo nucleotides) 技術 。他們用加錨定的微衛星寡核苷酸作引物,即在SSR 的5′端或3′端加上2～ 4 個隨機選擇的核苷酸,這可引起特定位點退火,從而導致與錨定引物互補的間隔不太大的重復序列間的基因組節段進行PCR 擴增。這類標記又被稱為ISSR ( Inter2simple
sequence repeat ) 、ASSR(Anchored simple sequence repeats) 或AMP2PCR 。在所用的兩翼引物中,可以壹個是ASSR 引物,另壹個是隨機引物。如果壹個是5′端加錨的ASSR 引物,另壹個是隨機引物,則被稱為RAMP 技術[19] 。用於ISSR2PCR 擴增的引物通常為16～18 個堿基序列,由1～4 個堿基組成的串聯重復和幾個非重復的錨定堿基組成,從而保證了引物與基因組DNA 中SSR 的5′或3′末端結合,通過PCR 反應擴增SSR 之間的DNA 片段。
優點：SSR 在真核生物中的分布是非常普遍的,並且進化變異速度非常快,因而錨定引物的ISSR2PCR 可以檢測基因組許多位點的差異。與SSR2PCR 相比,用於ISSR2PCR 的引物不需要預先的DNA 測序,也正因如此,有些ISSR 引物可能在特定基因組DNA 中沒有配對區域而無擴增產物,通常為顯性標記,呈孟德爾式遺傳,且具有很好的穩定性和多態性。
1. 3 ?第3 代分子標記
3. 1 ?SNP 標記技術。
單核苷酸多態性(Single nucleotide?polymorphism ,SNP) 被稱為第3 代DNA 分子標記,是指同壹位點的不同等位基因之間個別核苷酸的差異,這種差異包括單個堿基的缺失或插入,更常見的是單個核苷酸的替換,且常發生在嘌呤堿基(A 與G) 和嘧啶堿基(C 與T) 之間。SNP 標記可幫助區分兩個個體遺傳物質的差異,被認為是應用前景最好的遺傳標記。目前,已有2 000 多個標記定位於人類染色體上,在擬南芥上也已發展出236 個SNP 標記。在這些SNP 標記中大約有30 %包含限制性位點的多態性。
優點：檢測SNP 的最佳方法是DNA 芯片技術,最新報道的微芯片電泳(Microchip electrophoresis) ,可以高速度地檢測臨床樣品的SNP ,它比毛細管電泳和板電泳的速度可分別提高10 和50倍 。SNP 與第1 代的RFLP 及第2 代的SSR 標記的不同有2 個方面:其壹,SNP 不再以DNA 片段的長度變化作為檢測手段,而直接以序列變異作為標記;其二,SNP 標記分析完全摒棄了經典的凝膠電泳,代之以最新的DNA 芯片技術。
3. 2 ?EST 標記技術。
表達序列標簽( Expressed sequence Tag , EST)是美國國立衛生研究院(National Institutes of Health ,NIH) 的生物學家Venter 於1991 年提出的。隨著人類基因組計劃的開展,EST 技術首先被廣泛應用於尋找人類新基因,繪制人類基因組圖譜,識別基因組序列編碼區等研究領域,之後又被廣泛應用於植物基因組研究。EST 是指在來源於不同組織的cDNA 文庫中隨機挑選克隆、測序,得到部分cDNA 序列,壹個EST對應於某壹種mRNA 的cDNA 克隆的壹段序列,長度壹般為150～500 bp ,只含有基因編碼區域。
優點：EST可代表生物體某種組織某壹時間的壹個表達基因,所以被稱之為“表達序列標鑒”;而EST的數目則顯示出其代表的基因表達的拷貝數,壹個基因的表達次數越多,其相應的cDNA 克隆越多,所以通過對cDNA 克隆的測序分析可以了解基因的表達豐度。目前構建cDNA 文庫壹般都使用試劑盒,方法成熟,而且飛速發展的DNA 測序技術,也使得進壹步降低大規模DNA 序列測定成本成為可能 。