PCR(聚合酶鏈式反應)是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈,低溫(經常是60°C左右)時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結合,再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度(72°C左右),DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。基於聚合酶制造的PCR儀實際就是壹個溫控設備,能在變性溫度,復性溫度,延伸溫度之間很好地進行控制。
中文名
聚合酶鏈式反應
外文名
Polymerase Chain Reaction
簡稱
PCR
屬性
鏈式反應
PCR的創建
Khorana (1971)等最早提出核酸體外擴增的設想:“經DNA變性,與合適的引物雜交,用DNA聚合酶延伸引物,並不斷重復該過程便可合成tRNA基因。”
但由於當時基因序列分析方法尚未成熟,熱穩定DNA聚合酶尚未報道以及引物合成的困難,這種想法似乎沒有實際意義。加上70年代初分子克隆技術的出現提供了壹種克隆和擴增基因的途徑,所以,Khorana的設想被人們遺忘了。
1985年,Kary Mullis在Cetus公司工作期間,發明了PCR。Mullis要合成DNA引物來進行測序工作,卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱。
1983年4月的壹個星期五晚上,他開車去鄉下別墅的路上,猛然閃現出“多聚酶鏈式反應”的想法。
1983年12月,Mullis用同位素標記法看到了10個循環後的49 bp長度的第壹個PCR片段;
1985年10月25日申請了PCR的專利,1987年7月28日批準(專利號4,683,202 ),Mullis是第壹發明人;
1985年12月20日在Science雜誌上發表了第壹篇PCR的學術論文,Mullis是***同作者;
1986年5月,Mullis在冷泉港實驗室做專題報告,全世界從此開始學習PCR的方法。[1]
PCR原理
DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈,在DNA聚合酶的參與下,根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發現,DNA在高溫時也可以發生變性解鏈,當溫度降低後又可以復性成為雙鏈。因此,通過溫度變化控制DNA的變性和復性,加入設計引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。
但是,DNA聚合酶在高溫時會失活,因此,每次循環都得加入新的DNA聚合酶,不僅操作煩瑣,而且價格昂貴,制約了PCR技術的應用和發展。
耐熱DNA聚合酶--Taq酶的發現對於PCR的應用有裏程碑的意義,該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,不需要每個循環加酶,使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本,PCR技術得以大量應用,並逐步應用於臨床。