1 RFLP
這項技術是Grodzicker在1974年創立的。特定生物類型的基因組DNA被某種限制性內切酶完全消化後,會產生不同分子量的同源等位基因片段,或者說RFLP標記技術的基本原理就是通過電泳分離檢測這些片段的突變。例如,點突變(酶切位點的新壹代和去除)和壹段DNA的重組(如插入和缺失引起的酶切位點之間長度的變化)可導致酶切等位基因的變化,從而產生RFLP。該技術包括以下基本步驟:DNA提取;用DNA限制酶消化;凝膠電泳分離限制性片段;將這些碎片按照原來的順序和位置轉移到易操作的濾膜上;用放射性同位素或非放射性物質標記的DNA作為探針與膜上的DNA雜交(稱為Southern雜交);放射自顯影或酶檢測顯示不同材料在探針的限制性片段中具有多態性。
RFLP標記的主要特點是:(1)分布於整個基因組,數量幾乎是無限的;(2)無表型效應,不受發育階段和器官特異性的限制;(3)***顯性,可以區分純合子和雜合子;(4)結果穩定可靠;(5)DNA需要量大,檢測技術復雜,難以用於大規模育種實踐。
2 RAPD
由Williams = 1990創立,其基本原理與PCR技術壹致。
PCR技術是壹種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法。Mullis第壹個在試管中建立了反應系統。幾個小時後,極少量的目標基因或特定的DNA片段可以被擴增數百萬倍。其原理類似於細胞中的DNA復制過程。首先,當在接近沸點的溫度下加熱時,雙鏈DNA分子被分離成兩個單鏈DNA分子。然後,DNA聚合酶以單鏈DNA為模板,利用反應混合物中的四種脫氧核苷三磷酸(dNTPs)合成新的互補DNA鏈。以上過程是壹個循環,每個循環的產物都可以作為下壹個循環的模板。經過20-30個循環後,兩個引物之間的特異性DNA片段能以幾何數大量復制。
RAPD標記技術是用壹個(有時是兩個)隨機引物(通常是8-10個堿基)隨機擴增基因組DNA,然後用凝膠電泳分離擴增的遺傳物質的基因組DNA。如果特定引物結合區發生DNA片段插入缺失或堿基突變,可能導致引物結合位點分布發生相應變化,導致PCR產物增多或缺失或分子量變化。如果PCR產物增加或缺乏,就會產生RAPD標記。
RAPD標記的主要特點是:(1)不需要DNA探針,不需要序列信息來設計引物;(2)顯性遺傳(極少數* * *顯性),分不清雜合子和純合子;(3)技術簡單,不涉及分子雜交和放射自顯影;(4)4)DNA樣本需求量小,引物價格便宜,成本低;(5)實驗重復性差,結果可靠性低。
3 AFLP
Zabeau和Vos在1993發明的AFLP標記是基因組DNA限制性片段選擇性擴增產生的擴增產物的多態性,其本質是顯示限制性內切酶限制性片段的長度多態性,但這種多態性是通過擴增片段長度的不同來檢測的。這項技術結合了RFLP的穩定性和PCR技術的簡單高效。同時可以克服RFLP帶和RAPD技術不穩定的缺點。基本技術原理和操作步驟如下:首先用限制性內切酶消化基因組DNA,形成許多大小不同的隨機限制性片段;然後將這些片段的兩端與特異性寡核苷酸接頭連接;然後根據接頭序列設計引物。因為限制性片段太多,所有擴增後的產物在凝膠上很難分離。因此,在引物的第三端增加了1-3個選擇性堿基,這樣只有那些能與選擇性堿基配對的片段才能與引物結合並作為模板擴增,從而達到選擇性擴增限制性片段的目的。最後,用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離這些特異性擴增產物。
AFLP標記的主要特點是:(1)由於AFLP分析中可使用的限制性內切酶和選擇性堿基類型較多,因此該技術產生的標記數是無限的;(2)典型的AFLP分析,每個反應產物的條帶都在50-100之間,所以壹次分析可以同時檢測多個位點,多態性極高;(3) * *顯性,典型的孟德爾遺傳;(4)分辨率高,結果可靠;(5)目前這項技術受專利保護,分析用的試劑盒價格昂貴,實驗條件苛刻。
4次SSR(SSLP)
SSR(微衛星DNA),由Moore於1991年發現,是壹類由若幹(多為1-5)個堿基組成的DNA序列,壹般長度較短,廣泛分布於基因組的不同部位,如(CA) N (AT) N (GGC)。這就導致了SSR長度的高度變異性,而這正是SSR標記的基礎。微衛星DNA雖然分布在整個基因組的不同位置,但其兩端多為保守的單拷貝序列,因此可以根據這兩端的序列設計壹對特異性引物,通過PCR技術擴增出它們之間的核心微衛星DNA序列,並通過電泳分析技術獲得其長度多態性,即SSR標記。
SSR標記的主要特點是:(1)豐富,廣泛分布於全基因組;(2)等位基因變異多;(3)***顯性標記,可以鑒別雜合子和純合子;(4)實驗重復性好,結果可靠;(5)由於創建新標簽時需要知道重復序列兩端的序列信息,因此開發難度大,成本高。
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