純化標簽是壹種已知的蛋白質，或者肽段，可以融合到妳感興趣的蛋白質中。因為這些標簽很容易識別，有很多抗體可以選擇，非常容易檢測。標記的方法主要是重組DNA，即將攜帶妳感興趣的蛋白質的編碼DNA與標記整合，將質粒轉入細胞內。當質粒表達後，融合標簽將連接到妳的蛋白質上。
融合標簽的選擇很重要，接頭序列的選擇也很重要。接頭序列將妳的蛋白質連接到標簽上，以確保蛋白質能夠正確折疊並具有正常功能。
為什麽要使用融合標簽？
優勢:
(1)分離的蛋白質，即使沒有針對該蛋白質的特異性抗體。
(2)純化後，必要時需要切掉融合標簽。
(3)可以將多個標記附著到同壹蛋白質上用於多種目的。
(4)避免免疫沈澱過程中的抗體幹擾。
(5)熒光標記可用於觀察活細胞中的蛋白質。
缺點:
(1)有些標簽會影響蛋白質的功能。
(2)需要優化標簽位置。
本文只介紹各種標簽，並不能說哪種標簽壹定要放在哪個位置，完全取決於妳的實驗需求。
如果妳不確定妳的標簽在哪裏更好，妳需要嘗試幾種方案，比如改變或添加壹個蛋白酶位點，修改接頭序列，或者為不同的目的添加多個標簽。
目前，有三種主要類型的融合標簽:
表位標簽:壹般為短肽序列，可用於免疫技術應用，如WB、Co-IP。
親和標簽:壹般為長型，可用於蛋白質純化或增加蛋白質的溶解度。
熒光標記:可用於活細胞/死細胞，壹般用於成像實驗，如細胞定位和* * *表達實驗。
這完全取決於妳想研究的蛋白質:蛋白質是如何折疊的？哪壹端是功能性的？比如C端折疊在蛋白質內部，妳就檢測不到融合標簽的信號；或者翻譯後妳的蛋白質會在壹端被切掉，那麽妳的標簽也會被切掉。
如果不知道自己的蛋白質是怎麽折疊的，第壹次做的時候最好C端和N端都試試。據報道，C-末端融合蛋白比N-末端標記的融合蛋白更定位於預期的細胞區域。但事實並非完全如此。
並非所有的標簽都是壹樣的:每個標簽都有自己的用途和局限性。例如，妳需要使妳的蛋白質更易溶解，並使用標簽來純化它。串聯親和純化(TAP)。TAP最初是指將壹系列特定的結構域融合成蛋白質:金黃色葡萄球菌的鈣調素結合肽(CBP)和蛋白A(ProtA)，它們被煙草蝕刻病毒(TEV)的切割位點分開。然而，這種技術現在可以用於將2-3個融合標簽融合到蛋白質上，但通常它仍然包含TAP原始成分。這些標簽可以融合到蛋白質的壹端或兩端。如果標簽在使用後需要切斷，通常建議將標簽串聯起來。
他的標簽在TAP中被廣泛使用，因為它非常小，對於凈化實驗非常有效。通常與麥芽糖結合蛋白(MBP)壹起使用以增加溶解度。另壹種常用的組合是GFP和His。
TAP標簽雖然有很多優點，但是體積非常大，可能會破壞蛋白質的功能。此外，如果您使用含有CBP的標簽，它可能會幹擾鈣信號。所以，在妳的蛋白質上貼盡可能少的標簽。
有些小標簽對蛋白質的功能影響不大，但有些大標簽可能會有意想不到的效果。在這種情況下，妳通常需要在測試完標簽後將它剪掉。這需要使用特定位點的蛋白酶或肽。
位點特異性蛋白酶理論上不會影響妳的蛋白質功能。然而，蛋白酶通常在切割後被去除。壹種解決方案是將蛋白酶與標簽融合，並通過親和層析將其去除。幾個蛋白酶識別位點的選擇取決於妳的需求。需要註意的壹點是，融合標簽是在N端還是C端？從N端切掉標簽會留下更少的殘基，而從C端切掉標簽會在妳的蛋白質上留下4-6個以上的殘基。以下是幾種常用的蛋白酶位點列表(英文版，如有需要請自行查看):
親和標簽如此命名是因為它們經常用於親和純化。親和純化是壹種從細胞裂解物中純化蛋白質的技術。見下圖:
GST是由211個氨基酸組成的蛋白質，分子大小約為26KD。天然GST可以保護細胞免受有害成分和氧化應激。GST的特點是對三肽和谷胱甘肽有親和力，可用於親和層析。當含有GST的溶液通過固定有谷胱甘肽的柱時，GST與谷胱甘肽結合並從溶液中分離。結合後可用10mM谷胱甘肽洗脫。
註意事項:
(1)汙染:熱休克蛋白有時會被GST洗脫。妳可以通過SDS-PAGE膠看到這種汙染。為了去除熱休克蛋白的汙染，可以在純化前用5mM氯化鈣和5mM ATP處理細胞裂解液。
(2)蛋白質功能喪失:由於GST是壹個大標簽，通常以二聚體的形式存在於溶液中。它可能會降低妳的蛋白質活性和功能。可以使用蛋白酶(例如凝血酶、因子Xa或前切割)切割。
PolyHis標簽因其體積小、結合穩定而被廣泛用於蛋白質純化。雖然His標簽可以有2-10個組氨酸殘基，但最常用的是6×His標簽，或hexatag。組氨酸與固定的過渡金屬離子形成配位鍵，可用於蛋白質純化。鈷和鋅柱可用於固定金屬親和色譜(IMAC)，但通常使用鎳柱。因為His標簽是短肽序列，標簽的最佳位置取決於蛋白質特異性，並且它們很少影響融合蛋白的性質。
註意事項:
(1)內源性His: His殘基廣泛存在於哺乳動物和昆蟲中，因此有很高的背景信號。用5-10mM咪唑洗滌可以避免背景結合，但這會過早地洗掉妳的蛋白質。另外，用His抗體檢測時也要註意背景結合。
(2)不建議將帶有金屬中心的蛋白質融合到His-tag上，因為金屬可能會被親和樹脂吸附。
(3)應避免還原劑，如二硫蘇糖醇(DTT)或β-巰基乙醇，因為它們會降低樹脂的親和力。
生物素又稱維生素H，是壹種分子量為244Da的小分子。它通常附著在二抗上，作為ELISA和WB的可視化技術。生物素能與鏈黴親和素和親和素分子形成非常強的結合，可用於親和純化。因為生物素是小分子，不會影響蛋白質的功能。另壹個有價值的標簽是鏈球菌標簽。因為它的長度是8個氨基酸(WRHPQFGG)，所以不會影響蛋白質的功能，而且在同壹個口袋裏與生物素可逆結合。這意味著與Strep-tag融合的蛋白質可以通過使用strptavidin樹脂有效地純化，並在溫和的緩沖條件下用生物素洗脫。
註意事項:
(1)四聚體和單體的親和樹脂:生物素包被柱可用於純化生物素標記的蛋白，蛋白可以四聚體或單體形式使用。四聚體abidin色譜柱的洗脫過程需要強變性劑，如尿素或鹽酸胍，而單體樹脂用10mM生物素緩沖液即可溫和洗脫。
(2)哺乳動物系統包含至少四種生物素化的蛋白質，其將用感興趣的蛋白質洗脫。然而，在大腸桿菌系統中很少遇到非特異性結合。
表位是抗原的壹部分，被抗體識別。因此，表位標簽通常用於基於抗體的分析實驗。表位標簽壹般比親和標簽短，所以很少影響蛋白質的功能。盡管它們也可用於親和純化，但基於免疫抗體的柱價格昂貴，且不如親和標簽有效。而表位標簽在檢測上有很大的優勢。廣泛用於細胞培養和免疫沈澱。
人c-myc在增殖細胞中表達水平低，在人類腫瘤發生中起重要作用。c-myc標簽來源於C-myc基因的C端，可被抗體有效識別。因此廣泛應用於蛋白質檢測，如WB、免疫沈澱、流式細胞儀等。
註意事項:
(1)融合入分泌信號:c-myc標簽雖然可以放在蛋白質的N端或C端，但不建議融合入分泌信號通路，會影響分泌信號通路的定位。
(2)親和純化:雖然也可用於蛋白質純化，但很少使用。是因為洗脫需要在很低的pH值下進行，會影響蛋白質的功能。
人流感病毒血凝素(HA)標簽來源於HA糖蛋白，存在於流感病毒表面，負責病毒的傳染性。由於HA是小肽標簽，基本不會影響蛋白質的功能，可用於蛋白質檢測，如ELISA、WB、免疫沈澱等。抗HA抗體也可用於蛋白質純化。
註意事項:
親和純化:不推薦HA標簽標記雕亡細胞中的蛋白質。HA標簽會被caspase 3和caspase 7切割，導致免疫反應性下降。
DDDK或FLAG是唯壹的專利標簽(sigma)，比其他表位標簽更親水。如果需要，包含在DDDK標簽中的腸激酶切割序列可以將標簽從融合蛋白上切割下來。
註意事項:
親和純化:雖然抗DDDK抗體也能有效地純化蛋白質，但通常比其他色譜柱貴。
V5標簽來源於副粘病毒猿猴病毒中的P蛋白和V蛋白。V5標簽有兩種大小，9-14個氨基酸。但是比較長的常用。有時V5標簽與His-標簽結合使用。
需要註意的是:
交叉反應:如果使用哺乳動物表達系統，可能會發生交叉反應。
從1992開始，GFP基因被克隆，目前有很多熒光標簽可用。熒光標記最大的優點之壹就是無毒，所以可以用在活細胞中。雖然熒光標簽很大，但對大部分蛋白質功能影響不大。
雖然GFP是壹種大小為26.9KD的熒光標記，但也有許多其他標記可用。
如果妳打算使用多種熒光標記，選擇不同的激發和發射峰是非常重要的。如果發射峰重疊，則很難區分這兩種熒光。
通常，您希望使用可用光譜中最亮的熒光標記來標記蛋白質，這樣可以獲得清晰的信號，並克服任何潛在的背景熒光。亮度值是蛋白質的消光系數和量子產率的乘積。然而，獲得的數字可能難以解釋。因此，壹種常見的測量方法是將熒光標簽的亮度與標準標簽(如EGFP)進行比較。
成熟定義了熒光標記正確折疊、形成發色團並開始發射熒光的時間。在活細胞的時間敏感事件中，短的成熟時間非常重要。比如SfGFP，10分鐘就可以折疊，而mOrange壹般需要4個小時。
漂白是光穩定性的壹種量度。即發色團被激發後多久失去發光能力。如果妳準備做長時間延遲實驗，那麽考慮壹個光穩定性高的標簽。T-藍寶石的漂白半衰期為25秒，而EGFP則穩定得多，壹般為174秒。
像大多數蛋白質壹樣，熒光標記受ph值、溫度和氧氣水平的影響。根據您使用的條件，您可能需要選擇正確的標簽。
pH值會影響激發和發射峰，大多數熒光標記對酸敏感。有些甚至可以在pH值變化時改變熒光強度(例如pHTomato)。PKa值是pH敏感性的良好指標。
此外，溫度和氧氣水平都會影響成熟時間。缺氧通常會延遲成熟時間。然而，新的熒光標記UnaG即使在低氧水平的條件下也能發出熒光。
由於大多數熒光標記來自水母或珊瑚蛋白，而不是哺乳動物細胞或組織，因此可能使用的氨基酸密碼子存在物種差異，這可能導致表達水平低和信號弱。
幸運的是，許多新版本的熒光標簽已經針對哺乳動物的高表達進行了密碼子優化。所以在使用之前，妳需要確認妳的序列是否能在目標系統中表達。
還有壹個很重要的點就是確定妳的標簽是單體還是二聚體(單體通常用“m”表示，比如mCherry)。這會影響妳的實驗。很多早期的熒光標記很容易形成寡聚體，可能會影響妳融合蛋白的功能。例如，EGFP是壹種單體標簽，但在高濃度下，它可以形成二聚體，可以破壞亞細胞器或破壞FRET等實驗。