限制性內切酶可以特異性地結合到稱為限制性酶識別序列的DNA序列中或附近的特定位點，切割雙鏈DNA。可分為三類:ⅰ類和ⅲ類酶在同壹蛋白質分子中既有切割又有修飾(甲基化)，並依賴於ATP的存在。I類酶與識別位點結合，隨機切割離識別位點不遠的DNA，而III類酶在識別位點切割DNA分子，然後從底物解離。ⅱ類由兩種酶組成:壹種是限制性內切酶，它切割特定的核苷酸序列；另壹種是修飾相同識別序列的獨立甲基化酶。ⅱ類限制性內切酶已廣泛應用於分子克隆，是重組DNA的基礎。大多數ⅱ類限制性內切酶識別長度為4到6個核苷酸的回文對稱的特定核苷酸序列(如EcoRⅰI識別6個核苷酸序列:5’-G↓AATTC-3’)，少數酶識別更長的序列或簡並序列。在識別序列中，ⅱ類酶的壹些切割位點在對稱軸處被切割，產生平端DNA片段(如SMAⅰ:5’-CCC GGG-3’)；有些切割位點在對稱軸壹側，導致DNA片段帶有單鏈突出端，稱為粘端。例如，EcoRⅰⅰ切割識別序列並產生兩個互補的粘性末端。
5'…G↓AATTC…3'→5'…GAATTC…3 '
3'…CTTAA↑G…5'→3'…CTTAAG…5 '
DNA純度、緩沖液、溫度條件、限制性內切酶本身都會影響限制性內切酶的活性。大多數限制酶不受RNA或單鏈DNA的影響。當微量汙染物進入限制性內切酶儲存液時，會影響其進壹步使用，所以每次吸收限制性內切酶時都要使用新的移液器頭。如果使用兩種限制性內切酶，需要註意提供各自的最適鹽濃度。如果它們可以使用相同的緩沖液，它們可以同時被水解。如果需要不同的鹽濃度，必須先用低鹽濃度的限制性內切酶，然後調整鹽濃度，再用高鹽濃度的限制性內切酶進行水解。或者，在第壹次酶切反應完成後，用等體積的苯酚/氯仿萃取，加入0.1倍體積的3mol/LNaAc和2倍體積的無水乙醇，混合均勻，然後在-70℃冷藏30分鐘，離心，幹燥，重新溶解在緩沖液中，用於第二次酶切反應。
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