壹、PCR概述
1，什麽是PCR
聚合酶鏈式反應(PCR)也稱為體外特定DNA序列的無細胞分子克隆或引物導向的酶促擴增。由美國科學家PE(Perkin Elmer Perkin-Elmer)遺傳系的Mullis博士發明，由於PCR技術在理論和應用上的劃時代意義，Mullis獲得了1993諾貝爾化學獎。
2.PCR技術的發展歷史
PCR的原理是由壹對引物介導，能在動物和植物的體外快速酶促擴增特定的基因(DNA)片段。經過N個熱循環的擴增後，擴增產物中特異性基因的數目為(1+e) n (0 < e < 1，擴增效率為=倍，使得檢測擴增產物中的特異性基因成為可能。
聚合酶鏈反應從1993開始經歷了四代產品:
第壹代:人工/機器人水浴基因擴增
如上圖所示，用三個恒溫水浴箱將三個水浴的溫度保持在三個溫度:PCR的高溫變性溫度(如94℃)、低溫復性溫度(如58℃)和適當的溫度延伸溫度(如72℃)。然後用裝有PCR標本試管的籃子用手依次在不同溫度的水浴箱中洗澡，每個水浴箱中標本的恒溫時間用秒表計時。這樣，PCR樣品可以完成以下形式的熱循環:
94℃30秒58℃45秒72℃60秒
40個周期
這種方法的特點是:實驗人員勞動強度大，容易因疲勞而產生誤差；優點是:設備簡單，投資少，與全自動基因擴增儀相比，不需要升降溫過程，實驗時間短，實驗更接近理想的PCR反應條件。事實表明實驗效果還是不錯的，但是由於標本管從壹個水浴箱移動到另壹個水浴箱時暴露在空氣中的時間較短，如果移動速度不夠快也會對標本造成溫度幹擾，影響結果。這種方法的其他缺點還包括只能限制在三個溫度步驟(有些PCR反應需要三個以上的溫度步驟)，液體汙染，在低壓區很難將水溫燒至94℃變性溫度。
為了提高該方法的自動化水平，設計了機械手裝置來代替上述人工移動標本的過程，並組成了機械手水浴式基因擴增儀。這壹改進解決了實驗人員高強度勞動的問題，但也帶來了機械手部件在長行程中頻繁相對運動導致的高故障。這種類型的基因放大器在90年代中期的北京和上海都有銷售，並且被廣泛使用。它曾為我國分子生物學的發展做出過積極的貢獻，後來逐漸被自動化程度更高的放大器所取代，現在很少被單位使用。
第二代:自動控制定性基因擴增儀
相對於上述水浴式放大器，有人稱之為幹式基因放大器，是最具代表性的放大器，包括後面介紹的第三代和第四代，都是在第二代的基礎上，集成了定量檢測部分。
第三代:終點定量/半定量
第二代定性PCR只能判斷陰性和陽性，不能評價特定核酸的濃度和定量分析。定量PCR至少可以實現以下定性PCR無法實現的功能:
？潛伏病毒濃度檢測
？感染程度
？致病病原體的量變測定
？抗病毒藥物的療效評價
？恢復期病毒載量的檢測
自從美國ABI公司在1996年發明了第壹臺熒光定量PCR儀以來，PCR技術和應用從定性到定量發展迅速。終點定量PCR的優點是設備投資少。對於國內經濟條件負擔不起昂貴的實時熒光定量PCR儀的科研單位和醫療機構，可以使用現有的第二代常規定性PCR儀，增加專用單孔PCR終點產物熒光定量檢測儀開始工作，發揮定量作用。終點定量PCR技術是從定性向實時定量過渡的中間產物。而進口產品較少，國產儀器較多，如Xi安天龍的TL988和上海靈光的DA620。
第四代:實時定量PCR
實時定量QCPR儀+實時熒光定量試劑+通用計算機+自動分析軟件構成QPCR-DNA/RNA實時熒光定量檢測系統。
見下圖:(略)
2.實時熒光定量PCR的優勢:
該設備由熒光定量系統和計算機組成，用於監測循環過程中的熒光。連接到實時設備的計算機收集熒光數據。數據通過開發的實時分析軟件以圖表的形式顯示出來。原始數據被繪制成熒光強度對循環次數的圖。收集原始數據後，就可以開始分析了。實時設備的軟件可以對采集的數據進行歸壹化處理，以彌補背景熒光的差異。標準化後，可以設置閾值水平，這是分析熒光數據的水平。樣本達到閾值水平時所經歷的循環次數稱為Ct值(極限點的循環次數)。閾值的設定應使指數期的擴增效率最大化，這樣才能獲得最準確和可重復的數據。如果同時還有標有相應濃度的標準品，線性回歸分析會產生壹條標準曲線，可以用來計算未知樣品的濃度。
3.實時熒光定量PCR技術原理。
所謂實時Q-PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基因，利用熒光信號的積累實時監測整個PCR過程，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在實時技術的發展中，有兩個重要發現起著關鍵作用:(1)90年代初，Taq DNA聚合酶的核酸外切酶活性的發現，可以降解特定的熒光探針，使得間接檢測PCR產物成為可能。(2)之後，利用熒光雙標記探針在密閉的反應管中實時監測整個反應過程。這兩個發現的結合以及相應儀器和試劑的商業化發展導致了實時Q-PCR在研究工作中的應用。
PCR反應過程中產生的DNA拷貝數呈指數增長。隨著反應循環次數的增加，最終的PCR反應不再指數生成模板，從而進入平臺期。在傳統的PCR中，經常使用凝膠電泳分離和熒光染色來檢測PCR反應的最終擴增產物，因此通過這種終點方法來定量PCR產物是不可靠的。在實時Q-PCR中，實時監控整個PCR反應擴增過程，並連續分析與擴增相關的熒光信號。隨著反應時間的進行，監測到的熒光信號的變化可以繪制成曲線。在PCR反應的早期，熒光的水平無法與背景明顯區分，然後熒光產生進入指數期、線性期和最終平臺期，因此可以在PCR反應的指數期的某壹點檢測PCR產物的量，並由此推斷模板的初始含量。為了方便地比較檢測的樣品，在實時Q-PCR反應的指數期，需要設置壹定的熒光信號閾值。該閾值壹般以PCR反應前15個循環的熒光信號為熒光背景信號，默認設置為3 ~ 15個循環熒光信號標準差的65438。如果檢測到的熒光信號超過閾值，則認為是真實信號，可用於定義樣品的閾值循環數(Ct)。Ct值的含義是:每個反應管中的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環次數。研究表明，每個模板的Ct值與模板初始拷貝數的對數之間存在線性關系。初始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知初始拷貝數的標準品可以制作標準曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，就可以從標準曲線計算出樣品的初始拷貝數。
4.實時熒光定量PCR技術在醫療中的應用。
⑴病原體檢測:目前可利用熒光定量PCR檢測技術對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、結核分枝桿菌、EB病毒、巨細胞病毒等病原體進行定量檢測。與傳統檢測方法相比，它具有靈敏度高、樣品用量少、快速簡便等優點。
例如，結核病基因診斷的意義主要在於:
A.將結核桿菌與其他分枝桿菌區分開來；
B.檢測結核耐藥基因；
C.提高結核病的陽性檢出率。
⑵產前診斷:到目前為止，人們還不能治療遺傳物質改變引起的遺傳性疾病，只能通過產前監測減少患病嬰兒的出生，從而預防各種遺傳性疾病的發生。比如為了減少X連鎖遺傳病患兒的出生，從孕婦外周血中分離胎兒DNA，通過實時熒光定量PCR檢測其Y性別決定區基因，是壹種無創的方法，孕婦容易接受。
⑶藥物療效評價:對乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)的定量分析表明，病毒的多少與某些藥物的療效有關。高水平的HCV表達對幹擾素治療不敏感，而低滴度的HCV對幹擾素治療敏感。在拉米夫定治療過程中，HBV-DNA的血清含量壹度下降，之後又再次上升或超過以前的水平，提示病毒發生了變異。比如PCR在HBV檢測中的應用和意義；
A.了解體內乙肝病毒的數量。
B.是否復制。
C.是否有傳染性，傳染性有多大。
D.是否有必要吃藥。
E.肝功能異常變化是否由病毒引起。
F.判斷什麽樣的抗病毒藥物適合患者。
G.判斷藥物治療的療效。
⑷腫瘤基因的檢測:雖然腫瘤的發病機制尚未明確，但相關基因的突變是致癌轉化的根本原因已被廣泛接受。癌基因表達的增加和突變可出現在許多腫瘤的早期。實時熒光定量PCR不僅能有效檢測基因突變，還能準確檢測癌基因的表達。目前，該方法已用於檢測端粒酶hTERT基因、慢性粒細胞白血病WT1基因、腫瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關病毒基因等的表達。隨著腫瘤相關新基因的發現，熒光定量PCR技術將在腫瘤研究中發揮更大的作用。
(5)在優生學中的應用:
近年來，隨著經濟的快速發展和人民生活水平的逐年提高，人們越來越關註自己和家人的健康，尤其是下壹代的健康。此外，由於我國計劃生育工作的逐步深入，獨生子女增多，孩子的身體素質成為長輩關註的焦點。因此，如何提高新生兒的素質和人類的遺傳素質，也就是優生優育，變得非常重要。①避免有嚴重遺傳性疾病和先天性疾病的個體出生。②促進體力和智力優秀的個體繁衍。其中，避免有嚴重遺傳病和先天性疾病的個體出生，是優生優育最基本的內容。從臨床優生學的角度來說，具體工作包括孕期對母親和胎兒進行基因檢查，盡量排除常見遺傳性疾病的出生，檢查母親孕期是否有弓形蟲、風疹病毒、衣原體等壹些容易導致胎兒畸形的感染性疾病。以前主要用染色體分析來檢測遺傳病，但臨床上大多數遺傳病都是遺傳病而不是染色體病，染色體分析檢測不出來。如果采用PCR基因擴增結合單鏈構象多態性分析(sscp)、限制性片段長度多態性分析(RFCP)、等位基因特異性寡核苷酸酸(Aso)點雜交或差異PCR，可以很容易地檢測出單個基因的突變，準確率可以達到95%以上，所以這個問題得到了很好的解決。易導致胎兒畸形的常見傳染病病原體有單純皰疹病毒(HSV)、風疹病毒(RV)、人巨細胞病毒(HCMV)、TOX和沙眼衣原體(CT)。以往對這些病原體感染的診斷比較困難，主要通過培養方法進行診斷。但培養法費時、費錢，且受取樣、標本保存和用藥的影響，無法在臨床上推廣。PCR基因擴增法由於具有較高的敏感性和特異性，非常適合用於這些疾病的診斷和療效追蹤，是最值得推薦的檢測方法。
1.PCR基因擴增法在遺傳病產前診斷中的應用。遺傳性疾病是由於基因改變導致機體的某種功能、缺陷或異常而引起的疾病，根本的改變在於遺傳物質。其類型包括單基因遺傳病、染色體遺傳病和多基因遺傳病。遺傳病的診斷除了詢問病史、壹般體格診斷、壹般實驗室檢查和了解癥狀體征外，還有其特殊性。以往常以系譜分析、染色體和性別染色作為遺傳病診斷的主要依據，輔以相關酶學分析做出診斷。隨著分子生物學的迅速發展及其在遺傳性疾病診斷中的廣泛應用，基因診斷技術誕生了，極大地促進了遺傳性疾病的臨床診斷。聚合酶鏈反應(PCR)是基因診斷的主要技術之壹。這種快速靈敏的體外基因擴增技術可以檢測大多數已知的基因突變、基因缺失、染色體錯位等。PCR技術正日益成為診斷遺傳病最有效、最可靠的方法之壹。這裏有幾個在中國具有普遍意義的例子。
(1)通過PCR檢測地中海貧血；地中海貧血是壹種遺傳性慢性溶血性貧血，是世界上最常見也是最常見的單基因遺傳病。在廣東、廣西、貴州、四川等地發病率較高，廣西等地達到15%。地中海貧血是由於基因突變導致珠蛋白失衡，使結構正常的肽鏈合成減少甚至不能合成，表現為溶血性貧血。接受基因的類型分為α、β、γ，其中α、β地中海貧血最常見，危害最大。珠蛋白基因簇位於人類6號染色短臂上，有兩個重復基因位於α1，α2，兩個α基因及其側翼序列同源性很大，容易發生染色體不等交換，導致α基因缺失-α地中海貧血。α地中海貧血基因部分缺失包括α1基因部分缺失、α2基因缺失、α1和α2基因同時缺失和非缺失型地中海貧血。PCR可用於擴增α1和α2基因，檢測這些基因是否缺失或突變，從而診斷α地中海貧血。β地中海貧血的基因缺陷主要表現為基因序列中單個核苷酸的突變，或少數堿基的缺失或插入，使正常的β珠蛋白肽鏈合成減少或缺失。PCR產物與位點特異性寡核苷酸探針(Aso)的點雜交可用於診斷。
(2)苯丙酮尿癥:苯丙酮尿癥(PKU)是壹種常染色體隱性遺傳病。由於苯丙酸羥化酶轉化為酪氨酸，苯丙氨酸及其代謝產物在體內蓄積，導致腦損傷和不可逆的智力低下。PKU患者出生時正常。新生兒壹旦確診為PKU，停止母乳餵養，采用低苯丙氨酸口服治療8-10年，可保持患者智力水平發育正常。因為口服低苯丙氨酸非常昂貴，普通家庭難以承受。所以產前診斷是防止孩子出生的最佳選擇。PAH只在肝細胞中表達，酶活性無法通過血細胞、成纖維細胞、羊水、絨毛膜細胞分析，只能通過基因診斷。PKU的基因改變不是所有PAH基因的缺失，主要形式是點突變，突變位點多。必須使用PCR擴增、ASO、SSCP或擴增片段長度多態性分析(AmpFLA)進行檢測。這些技術很復雜，檢查員必須經過專業培訓。
(3)血友病，血友病是壹組最常見的遺傳性凝血障礙，根據因子缺陷的不同可分為兩種，(因子ⅷ和ⅶ缺陷)，也有復雜性血友病，但不常見。血友病A的發病率為1/10000，因子VIII基因位於G6PD基因附近，全長186Kb。廣泛基因重排(缺失、插入和重復)導致的血友病A病例很少，僅占因子ⅷ缺陷的5%，大多數患者表現為單個或少數堿基突變。由於因子ⅷ基因長度為186Kb，突變位點多，新突變頻率高，從臨床角度不可能檢測到每壹個突變，可以檢測到幾種常見的突變類型。主要的檢測方法是PCR結合RELP分析。血友病B的發病率占血友病的20%，其基因改變和檢測方法與血友病a相似。
(4)性發育異常。區分男女的物質基礎是性染色體。在哺乳動物胚胎發育中，雌性表型不需要任何調節，而雄性表型由許多因素決定。位於Y染色體上的基因指導男性的SSS，被稱為睪丸決定簇(TDF)。現代研究表明，SRY(Y染色體性別決定區)基因是TDF基因，位於Y染色體短臂末端。SRY區的缺失容易導致46XY核型個體發育為雌性。基因檢測可以檢測SRY基因組的易位和缺失，從而診斷性別發育異常。這項探索性別異常的研究很受歡迎。此外，還有壹種46XY核型異常的患者，即睪丸女性化，這是由於雄激素受體(AR)基因的缺失，使雄激素的靶基因對雄激素沒有反應或回答不完全所致。根據病情不同，有不同的表現型，AR缺乏癥新突變頻率高，表現為散發性疾病，無家族史。AR基因長90Kb，位於X染色體上。AR基因異常多為個別基因的堿基突變，可通過PCR結合ASO或SSCP檢測出來。
(5)脆性X綜合征，脆性X綜合征(FRAX)是壹種發病率最高的X連鎖精神發育遲滯綜合征(XLMR)。它之所以被命名，是因為這種綜合征與X染色體上的脆性部位有關。大多數FRAX男人的智商都在50以下，而且隨著年齡的增長，智商有下降的趨勢。通過人工酵母染色體(YAC)克隆技術分離出壹個覆蓋X-脆性位點的YAC克隆，並在該克隆中獲得了壹個能在人腦中表達的基因，命名為FMR-1(脆性X-mentai阻滯-1)。在FMR-1的5’端有壹個CGG三核苷酸串(CGG)n。正常人群中(CGG)n存在多態性，有6-46個重復。當重復數超過52時，該區域的劃分不穩定，導致重復數大量增加。無臨床表現的載體插入片段長度小於500bg，是臨床的。人們把500bp作為預突變和全突變的分界線。在Frax診斷之前，細胞遺傳學用於檢測脆性位點，但實驗條件嚴格，成功率不高。目前可以通過分子遺傳學診斷預突變和全突變。通過PCR擴增CGG重復序列，並檢測擴增產物的長度。突變基因的擴增片段被放大，出現體細胞異質性時出現多條長短不壹的擴增帶甚至是壹條尾巴，或者因為擴增的全突變插入片段過長超過PCR擴增能力而沒有擴增現象。
2.PCR基因擴增技術在“Torsch”診斷中的應用。在妊娠早期(1-3個月)，壹些病原微生物容易引起胎兒畸形。最常見的病原體是托克斯病毒、風疹病毒(RV)、單純皰疹病毒(HSV)、沙眼衣原體(CT)和巨細胞病毒(HCMV)。
(1)弓形蟲PCR檢測表明，弓形蟲自然疫源地廣泛，人體內多為隱性感染，在抵抗力較低時可有臨床表現。弓形蟲診斷困難，血清學方法敏感性高，但存在交叉假陽性且無法確定近期感染、長期感染或短暫感染。診斷的方法是活檢或動物活檢，這些方法的陽性率太低，難以推廣。PCR檢測可檢出樣本中1-2病原體，準確率高，是目前檢測弓形蟲最好的方法。作為產前產後檢查，應在孕前或孕早期抽取全血樣本。可使用EDTA或肝素抗凝，EDTA抗凝效果最好，用於檢測外周血白細胞中是否存在TOX。弓形蟲檢測對於不孕、反復自然流產或飼養小動物的產婦有更重要的臨床意義。
(2)風疹病毒感染:風疹病毒(RV)是單壹陽性RNA病毒，人類是風診病毒的唯壹宿主。RV感染可導致胎兒畸形，影響胎兒免疫系統的發育，因此RV檢測在產前和產後保健中非常重要。RV可通過直接培養和IgM抗體試驗進行檢測。培養方法耗時長，且常受其他病毒幹擾。IgM法不準確，PCR法敏感特異，簡單快速，是RV感染的最佳檢測方法之壹。風疹病毒侵入體內後在上呼吸道內增殖，導致面部出現癥狀和丘疹，並迅速擴散至全身。樣品為孕婦的咽拭子、血清、孕婦絨毛或孕婦羊水等。RV病毒是RNA病毒，PCR擴增比較復雜，要註意樣本采集的時機和操作的準確性。
(3)單純皰疹病毒:單純皰疹病毒(HSV)是壹種DNA病毒，可引起多個器官的炎癥，可通過性接觸傳播。HSVⅱⅱ感染復發率高，80%的感染者在12個月內復發。HSV感染被免疫系統消除後，少數患者終身攜帶，虛弱時復發。PCR檢測HSV敏感，可直接鑒定HSVⅰ/ⅱ型。
(4)沙眼衣原體，沙眼衣原體(CT)是壹種性傳播疾病，不僅可引起沙眼還可引起生死器官的感染。與淋病(NG)、梅毒等經典性傳播疾病不同，CT很容易通過其他接觸途徑傳播。少數地區孕婦調查結果顯示，該人群發病率高達20%-30%。在歐美等國家，CT感染已經超過淋病，位居性傳播疾病之首。衣原體感染往往是隱性感染，無癥狀或無特異性癥狀，不易診斷。過去的培養方法耗時長，缺乏靈敏性和準確性。PCR用於CT檢測時，要註意針對不同的檢測目的使用不同的材料。對於性傳播疾病的診斷，要取生殖道分泌物(查脫落細胞)，而對於早孕患者，要查其全血樣本，然後在孕晚期或臨產時查陰道分泌物，以指導產道的清理。
(5)人巨細胞(HCMV)，HCMV感染十分常見，除少數原發感染伴有原發性單核細胞增多癥外，大部分為隱性感染。HCMV可以在體內潛伏很長時間。當機體免疫功能低下時，病毒就會激活，引發嚴重疾病。如果孕婦在懷孕期間感染HCMV，會導致早產、畸形、死胎和新生兒巨細胞包涵體病。HCMV屬於皰疹病毒家族，可從唾液、尿液、宮頸分泌物和乳汁中分泌。HCMV的“金標準”診斷檢測是用單層成纖維細胞進行病毒培養，其他實驗檢測包括血清學檢測和包涵體檢測。PCR是壹種新的HCMV檢測方法，用於檢測的樣本包括血液、生殖道分泌物拭子等。用於產前和產後保健時，應采集血樣。對於妊娠早期HCMV感染患者，應再次檢測羊水或其他妊娠產物，並對患者進行仔細隨訪，以做出綜合判斷並采取相應的醫學措施。
PCR在優生學中的應用具有很大的優勢，使得這項技術的推廣應用才剛剛起步。應註意手術的準確性，盡量避免誤診。對於傳染病，應先取孕婦血樣進行檢測，當有懷疑或血液中檢出病原體核酸時，應盡快對孕婦進行羊水等檢查。無論是否懷疑胎兒有嚴重的遺傳易感性和中度的感染導致畸形的風險，都應尊重胎兒父母的意見。
5.實時熒光定量PCR技術在研究中的壹些應用。
壹是新藥、人用藥物和其他藥物的研發
對於壹些感染性疾病藥物，如各種病毒性疾病、細菌性疾病，在新藥研發過程中，可以為新藥研發節省大量的人力、時間和資金。與Elisa和以前使用的其他方法相比，實時熒光定量PCR技術可以快速、準確、定量和靈敏地確定血液或組織中病原體的含量，因此有助於分析藥物的效果，以及比較不同配方的療效、劑量和成本。
該方法不僅可用於人類藥物，也可用於動物藥物，甚至可用於其他經濟動植物的藥物研究，因此其在藥物研究中的應用範圍非常廣泛。
二是超早期感染藥物和療法的研發
實時熒光定量PCR用於確定血液中病毒核酸的含量，因此不必等到患者體內產生抗體。同時，由於其靈敏度與Elisa不可同日而語，因此可在病毒感染的早期，即血液中病毒含量很低的時候確定。所以出現了壹個新的領域，就是在病毒或細菌含量很低的情況下如何用藥，用什麽藥，用藥量多少等等，為在超早期消滅疾病做出貢獻。
三、藥物療效研究，人用藥物和其他藥物
對於壹些已經上市的新藥或長期使用的老藥，可以進壹步研究用藥的效果、劑量和時間，從而進壹步研究這些藥物的合理應用，造福人類。因為過去用的方法不能準確量化，靈敏度不夠，所以需要研究的東西很多。壹方面，這個領域有很多值得研究的地方，也有很重要的意義。
第四，研究新的預後指標
對於感染性疾病，認為藥物作用到壹定程度後可以停藥，但目前還沒有明確的何時停藥的指標。由於檢測方法的靈敏度和準確度的限制，這個指標可能並不合理。因此，有必要進壹步研究治愈指數及其與復發率的關系以及疾病向其他疾病的轉化，為藥物或療法徹底治愈疾病奠定堅實的理論基礎。
動詞 （verb的縮寫）開發新的診斷和測試試劑
現有的許多診斷檢測方法不能同時滿足快速、靈敏和定量的要求，如現有的培養法和Elisa法，而熒光定量PCR法可以做到這壹點，從而為臨床疾病、商品檢驗、糧油檢驗、食品檢驗、血液檢驗等開發新的試劑。，從而提高檢查的靈敏度、速度和準確度等。這類試劑種類繁多，研制出來的試劑社會效益和經濟效益是巨大的。
六、血液檢驗漏檢率
由於實時熒光定量PCR比Elisa靈敏得多，血站或血液研究所壹般用它來研究Elisa的漏檢率，即分析Elisa為陰性的血液樣本，再用實時熒光定量PCR復檢。復檢時，壹般是將24份Elisa陰性的血樣混合成壹份樣本進行檢測。用這種方法在上海血液制品使用的血液中發現了壹例HIV，通過對供體的檢測，確認患者為HIV陽性。北京市紅十字血液中心正在測算北京血站5萬份Elisa陰性血樣的漏檢率。因為不同地區使用的Elisa試劑、方法、批號都不壹樣，所以需要在不同地區開展這項工作。
由於熒光定量PCR快速、靈敏、定量的特點，其在研發中的應用眾多，如研究個體基因型與藥物療效的關系。研究人員也可以根據自己的研究項目開發新的用途。
TL988實時熒光定量PCR檢測系統產品介紹
1，如何選擇合適的PCR儀
回顧分子生物學的發展，PCR技術的發明和普及無疑是最重要的篇章之壹。在近20年來PCR技術的不斷發展和創新中，最引人註目的是實時定量PCR (ORQPCR)。定量PCR技術真正實現了從定性到定量PCR的飛躍。通過實時監控PCR過程，可以特異、靈敏、快速、可重復地準確定量初始模板濃度，在科學研究和臨床診斷中得到了越來越廣泛的應用。我公司從熒光定量PCR的原理入手，詳細介紹了熒光定量PCR儀的種類和技術，為定量PCR儀的選擇提供了詳細的參考。
定量PCR儀主要由兩部分組成，壹部分是PCR系統，另壹部分是熒光檢測系統。從上面的原理介紹中不難看出選擇定量PCR儀的關鍵——因為定量PCR必須通過樣品和標準品的對比來進行定量，對於壹個定量PCR系統來說，重要的參數不僅僅是溫度控制的精度、溫度上升和下降的速度等。傳統PCR，而且樣品孔之間的均勻性，以避免微小的差異被成倍放大。至於熒光檢測系統，多色多通道檢測是當今的主流趨勢——儀器的激發通道越多，儀器的熒光素種類就越多，儀器的適用範圍就越廣；多通道是指可以同時檢測壹個樣品中的多種熒光，儀器可以同時檢測單個試管中的多個模板或內標+樣品。通道越多，適用範圍越廣，儀器性能越強。熒光檢測系統主要包括激發光源和檢測器。激發光源包括鹵鎢燈光源、氬離子激光器和LED光源。前者可配多色濾光片實現不同激發波長，而單色LED價格低、能耗少、壽命長。但是因為是單色的，所以需要不同的led來更好的實現不同的激發波長。監控系統包括超低溫CCD成像系統和光電倍增管。前者可以壹次成像多個點，後者靈敏度高但壹次只能掃描壹個樣本。逐個掃描檢測多個樣本需要很長時間。定量PCR儀需要考慮的另壹個因素是軟件設計，目前較新的儀器都有很好的配套軟件來滿足日常使用。-隨著定量PCR技術在臨床診斷中的應用，疾病