RevertAid？第壹鏈cDNA合成試劑盒
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分析許可證
警告
建議第壹鏈cDNA的合成應在消除RNA酶汙染的條件下進行。移液管吸頭和試管必須用0.1% DEPC處理(在0.1%水溶液中浸泡過夜，在100℃加熱30分鐘，高壓滅菌)。強烈推薦戴手套。
重要！
儲存在-20℃下。
(如果對照RNA在-70℃長期保存)。
對照RNA避免了反復冷凍和解凍。將對照RNA融化並在冰上操作。
很多。:1210
參見包裝標簽了解保質期。
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該試劑盒設計用於從RNA模板制備全長第壹鏈cDNA。RevertAid？第壹鏈cDNA合成試劑盒依賴於壹種基因工程產品:莫洛尼小鼠白血病病毒逆轉錄酶(RevertAid？M-MuLV RT).這允許從長模板(最大13 kb)合成全長cDNA。RevertAid？由M-MuLV RT合成的第壹鏈cDNA的位置由不同的引物決定:
隨機六聚體引物:總RNA中的所有RNA都是RNA模板上非特異性位置的cDNA合成的模板。
Oligo(dT)18:在poly(A)+ mRNA的3’-末端。在這種情況下，只有帶有3’-聚腺苷酸尾的mRNA是cDNA合成的模板。
序列特異性引物:在引物結合位置。
由該系統合成的第壹鏈cDNA可用作PCR*模板。因為cDNA合成和PCR的反應條件是相同的，cDNA反應混合物可以直接加入到PCR混合物中。合成的第壹鏈cDNA也可以用作第二鏈合成的模板。放射性標記的DNA可以用作雜交探針。
具有3’-聚腺苷酸尾的1.1 kb RNA用作對照。
*PCR過程由Hoffmann-laroche公司負責。
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套件內容
1.RevertAid？M-MuLV逆轉錄酶(200u*/？l):
15?l酶溶於儲存緩沖液:50 mm tris-HCl (pH 8.3)，0.1 m NaCl，1 mm EDTA，5 mm DTT，0.1% Triton？X-100和50%甘油。
2.核糖核酸？核糖核酸酶抑制因子(20u**/？l):
15?將酶溶解在儲存緩沖液中:20 mm hepes-NaOH (ph 7.5)，50 mm NaCl，8 mm dtt，0.5 mm洗脫劑？清潔劑和50%甘油。
3.5x反應緩沖液:
100?15x反應緩沖液:250mm tris-HCl(25℃時pH 8.3)，250 mm KCl，20 mm MgCl2，50 mm DTT。
4.10毫米dNTP混合物:
30?L 10mM dGTP，dATP，dTTP，dCTP水溶液。
5.寡核苷酸(dT)18引物:
15?l 0.5？g/？L (15A260單位/毫升)水溶液。
6.隨機六聚體引物:
15?l 0.2？g/？L (6A260單位/毫升)水溶液。
7.對照底漆:
15?l 10pmol/？l(1.7a 260單位/ml) 17聚體水溶液。
8.對照RNA:
15?L 1.1 kb 65438帶3'-poly(A)尾+0.1 kb RNA，0.5？g/？l .
9.DEPC處理水:
2 x 1.5毫升去離子水在amilili-q上？裝置中的去離子和DEPC處理。
*壹個單位RevertAid？M-mulvrt: 1納摩爾dTMP在37℃10分鐘與多核苷酸片段結合(吸附在DE-81中)。
* *壹個單位核糖核酸？RNA酶抑制劑:抑制5 ng RNase酶A活性50%。
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操作程序
1.合成適合PCR擴增的第壹條cDNA鏈。
①在冰上的試管中制備以下反應混合物:
模板RNA*:
總RNA 0.1-5微克。
或者poly (a)+RNA 10 ng-0.5 μ g。
或者特異性RNA 0.01pg-0.5μg g。
底漆:
寡核苷酸(dT)18引物(0.5微克/微升)1微升
或者隨機六聚體引物(0.2微克/微升)1微升。
或序列特異性引物15–20 pmol。
DEPC處理水至12微升
輕輕混合並離心3-5秒。
②將混合物在70°C下孵育5分鐘，用冰冷卻，短暫離心，收集沈澱物。
③將試管置於冰上，並按指定順序添加以下成分:
5倍反應緩沖液4微升
核糖核酸？核糖核酸酶抑制因子(20u/μl) 1μl
10毫米dNTP混合物2微升
輕輕混合，短暫離心，收集沈澱。
④在37℃孵育5分鐘(隨機六聚體引物在25℃孵育5分鐘)。
*反應所需的總RNA或poly(A)+ RNA的量取決於基因的表達水平。
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⑤加入RevertAid？M-MuLV逆轉錄酶(200 u/μ l) 1 μ l
最終體積為20微升
⑥將混合物在42°C下孵育60分鐘(隨機六聚體引物在25°C下孵育10分鐘，最後在42°C下孵育60分鐘)。
⑦在70℃下加熱65438±00分鐘以終止反應。又冷又冷。
合成的第壹鏈cDNA可直接用於PCR擴增。PCR可以用以下產品完成:
Taq DNA聚合酶(推薦)(# ep0401、# ep0402、# ep0403、# EP 0404)；
Taq DNA聚合酶(天然的，不含BSA) (# ep0281、# ep0282、# ep0283、# EP 0284)；
Taq DNA聚合酶(天然的，不含BSA) (# ep0071，# EP 0072)；
2mM dNTP混合物(# r0241，# r 0242)；
10毫米dNTP混合物(# r0191，# r0192)。
註意:
1.不需要首先從總RNA中分離出poly(A)+ RNA，但可以提高最終產物的產量和純度。
2.RNA樣本不能被基因組DNA汙染。
3.oligo(dT)18引物不需要優化條件，但根據反應中合成的cDNA平均長度，隨機六聚體引物與RNA的比例是嚴格的。增加六聚體/RNA的比例將導致更短(~500 bp) cDNA的更高產量，而降低該比例將導致更長的產物。
4.將反應溫度提高到45°C可以緩解富含GC mRNA的二級結構問題。
5.反應產物的分析(見第4章)cDNA需要[32P]放射性標記。為此加入RevertAid？加10μCi[？-32P]dNTP(例如dATP)加入到反應混合物中。加入1μl 0.5M EDTA終止反應，置於冰上。
6.合成的cDNA應儲存在-20℃下..
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2.合成適合第二鏈合成的第壹鏈cDNA。
①在冰上的試管中制備以下反應混合物:
模板RNA*:
聚腺苷酸+ RNA 1微克
或者特異性RNA 0.5-1 μ g。
底漆:
寡核苷酸(dT)18引物(0.5微克/微升)1微升
或者隨機六聚體引物(0.2微克/微升)1微升。
或序列特異性引物100pmol。
DEPC處理水至12微升
輕輕混合並離心3-5秒。
②將混合物在70°C下孵育5分鐘，用冰冷卻，短暫離心，收集沈澱物。
③將試管置於冰上，並按指定順序添加以下成分:
5倍反應緩沖液4微升
核糖核酸？核糖核酸酶抑制因子(20u/μl) 1μl
10毫米dNTP混合物2微升
輕輕混合，短暫離心，收集沈澱。
④在37℃孵育5分鐘(隨機六聚體引物在25℃孵育5分鐘)。
⑤加入RevertAid？M-MuLV逆轉錄酶(200 u/μ l) 1 μ l
最終體積為20微升
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⑥將混合物在42°C下孵育60分鐘(隨機六聚體引物在25°C下孵育10分鐘，最後在42°C下孵育60分鐘)。
⑦在70℃下加熱65438±00分鐘以終止反應。又冷又冷。
合成的第壹鏈cDNA可用於第二鏈合成。可以用下列產品完成合成:
DNA聚合酶I (#EP0041，# EP 0042)；
T4 DNA連接酶(# el0014，# el0011，# El 0012)；
核糖核酸酶H (#EN0201，# EN0202)；
核酸酶S1 (#EN0321)。
筆記
1.為了提高合成的特異性和效率，poly(A)+片段必須從總細胞RNA中分離出來。
2.oligo(dT)18引物不需要優化條件，但根據反應中合成的cDNA平均長度，隨機六聚體引物與RNA的比例是嚴格的。增加六聚體/RNA的比例將導致更短(~500 bp) cDNA的更高產量，而降低該比例將導致更長的產物。
3.將反應溫度提高到45°C可以緩解富含GC mRNA的二級結構問題。
4.反應產物的分析(見第4章)cDNA需要[32P]放射性標記。為此加入RevertAid？加10μCi[？-32P]dNTP(例如dATP)加入到反應混合物中。加入1μl 0.5M EDTA終止反應，置於冰上。
5.合成的cDNA應儲存在-20℃下..。
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3.合成具有高比放射性的第壹鏈
①在冰上的試管中制備以下反應混合物:
模板RNA*:
聚腺苷酸+ RNA 0.5微克
底漆:
寡核苷酸(dT)18引物(0.5微克/微升)1微升
或者隨機六聚體引物(0.2微克/微升)1.5微升。
或序列特異性引物100pmol。
DEPC處理水至8μl
輕輕混合並離心3-5秒。
②將混合物在70°C下孵育5分鐘，用冰冷卻，短暫離心，收集沈澱物。
③將試管置於冰上，並按指定順序添加以下成分:
5倍反應緩沖液4微升
核糖核酸？核糖核酸酶抑制因子(20u/μl) 1μl
10毫米dGTP，dCTP，dTTP混合物1微升
0.1毫米dATP* 4微升
輕輕混合，短暫離心，收集沈澱。
④在37℃孵育5分鐘(隨機六聚體引物在25℃孵育5分鐘)。
⑤加入:
[?-32P]dATP(10毫微克/毫升)1微升
RevertAid？M-MuLV逆轉錄酶(200u/μl) 1μl
最終體積為20微升
*本套件中不包括單獨的dNTP解決方案。使用dNTP集合(#R0181)進行合成。。
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⑥將混合物在42°C下孵育60分鐘(隨機六聚體引物在25°C下孵育10分鐘，最後在42°C下孵育60分鐘)。
⑦加入5μl 0.5m EDTA終止反應。
⑧如有必要，加入等體積(25 μ l)的0.6N NaOH水解RNA，並在70°C下孵育30分鐘。
⑨在Sephadex？通過G-50柱層析去除未結合的dNTPs。
具有高比活性(>:107 dpm/μg)的第壹鏈cDNA可用作Southern雜交探針。
註意:
為了獲得比活性更高(超過108dpm/μg)的cDNA，100μCi的[？向反應混合物中加入-32P]dATP。如果最終反應體系大於20μl，10μl [？-32P]dATP (10mCi/ml)並將制備的反應混合物轉移至該試管中(5步)。然後繼續合成。
4.分析第壹鏈cDNA產物。
堿性瓊脂糖凝膠電泳只能鑒定或分析放射性標記的cDNA產物。
確定第壹條cDNA鏈的產量。
①將1μl樣品點至兩片DE-81濾膜(1.5x1.5cm)。
(2)烤燈烘幹濾膜。保留壹個濾膜，直接用它來測定樣品的總放射性。
③另壹濾膜沖洗5min10ml 7.5%(w/v)na 2 hpo 4x 12H2O 5分鐘三次；用水、丙酮或96%乙醇沖洗。
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(4)烤燈烘幹清洗後的濾膜。
⑤將兩個濾膜(未清洗和清洗過的)轉移到放射性計數器中，並進行計數。
⑥用下列公式計算第壹條cDNA鏈的產量:
如果dNTP的最終濃度為1.0mM，則(20μl)中的dATP摩爾數為2x10-8摩爾。標記的dATP數量相當少，可以忽略。然而，在具有高比活性的cDNA的情況下(第3章)，未標記的dATP的最終濃度為0.02 mm..為了計算測量中的摩爾dATP，有必要將未標記摩爾和標記摩爾相加。
MW是核酸的平均分子量，等於333x106 μg/mol。因為四個dNTP都參與反應，所以MW乘以4。
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例如:例如:
如果洗過的濾膜產生4x104dpm，未洗過的濾膜產生1.8x 106 DPM；
所以:
cDNA產量(μg)= 4x 104 DPM x(2x 10-8mol dATP)x 4x(333 x 106μg/mol)= 0.59μg
1.8x106dpm
cDNA產量% = 0.59微克x 100% = 59%
1微克
堿性瓊脂糖凝膠電泳分析
用[32P]標記的第壹鏈cDNA的合成產物可以通過堿性瓊脂糖凝膠電泳進行分析。類似地，合成產物和所用的DNA標記物都應該用[32P]標記。
①制備1.4%瓊脂糖凝膠(30mM NaCl，2mM EDTA)，在堿性電泳緩沖液(30mM NaOH，2mM EDTA)中平衡至少1h。
②樣品(1x105 dpm)，轉移到壹個單獨的試管中，並用5μl水稀釋。添加5μl 2x加載緩沖液。
(60mM NaOH，2mM EDTA，6% Ficoll？400，0.05%溴酚藍)。標記的DNA標記應該用相同的2x加載緩沖液稀釋。
註意2x上樣緩沖液應保持在-20°C，或者在使用前加入染料。
(3)加入樣品並在堿性瓊脂糖凝膠中以5V/cm進行電泳，直到染料遷移到接近凝膠2/3的位置。
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④凝膠在室溫下浸泡在7%三氯乙酸(TCA)中30分鐘。
⑤凝膠在凝膠幹燥機上真空幹燥或在玻璃板壓制的多層紙巾下幹燥1-2小時。
⑥用塑料蓋蓋住幹燥的凝膠，將x光膠片在室溫下曝光過夜。
控制綜合
提供具有3’-聚腺苷酸尾的1.1 kb RNA作為對照。
①在冰上的試管中制備以下反應混合物:
模板RNA*:
對照RNA 0.5微克
底漆:
寡核苷酸(dT)18引物(0.5微克/微升)1微升
或者隨機六聚體引物(0.2微克/微升)1微升。
或對照(序列特異性)引物(10 pmol) 2 μ l
DEPC處理水至11μl
輕輕混合並離心3-5秒。
②將混合物在70°C下孵育5分鐘，用冰冷卻，短暫離心，收集沈澱物。
③將試管置於冰上，並按指定順序添加以下成分:
5倍反應緩沖液4微升
10毫米dNTP混合物2微升
核糖核酸？核糖核酸酶抑制因子(20u/μl) 1μl
輕輕混合，短暫離心，收集沈澱。
④在37℃孵育5分鐘(隨機六聚體引物在25℃孵育5分鐘)。
⑤加入:
[?-32P]dATP(10毫微克/毫升)1微升
RevertAid？M-MuLV逆轉錄酶(200u/μl) 1μl
最終體積為20微升
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⑥將混合物在42°C下孵育60分鐘(隨機六聚體引物在25°C下孵育10分鐘，最後在42°C下孵育60分鐘)。
⑦加入1μl 0.5M EDTA終止反應，置於冰上。
⑧分析產品(見第4章)。
註意:
1.當使用對照RNA時，第壹鏈cDNA的產量通常超過50%。
2.如果對照用寡(dT)18或對照(序列特異性)引物合成，可以觀察到1.1 kb的清晰條帶。如果使用隨機六聚體引物，通常可以觀察到幾條短帶。
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常見問題
低產率和檢測不到產物是逆轉錄酶反應失敗的兩個明顯標誌。
可能的原因檢查和補救
DNA模板降解。乙二醛和甲醛凝膠電泳檢測RNA模板的完整性。對照RNA在凝膠中應具有1.1kb的亮帶。處理樣本RNA時，註意不要被RNA酶汙染。將模板RNA和對照RNA保存在-70°C，避免樣品反復凍融，融化後放在冰上。
核糖核酸酶汙染了反應混合物。使用對照並分析所得產物(參見對照的合成)。在無菌條件下制備反應混合物，始終戴手套，並用DEPC處理所有與樣品接觸的器具。主要是不汙染溶液。
RevertAid？M-MuLV逆轉錄酶抑制劑(SDS、EDTA、胍鹽、磷酸鹽、焦磷酸鹽、多胺、精胺、亞精胺)。將1μg對照RNA混入RNA樣品中，同時合成。如果使用oligo(dT)18或對照引物，合成的產率應該在50%以上，並且可以看到1.1kb的明亮的附加帶。用96%乙醇沈澱RNA樣品，並用75%乙醇洗滌(應使用DEPC處理過的水制備乙醇溶液)。不要向反應混合物中添加抑制劑。
不正確的引物與其他引物壹起用於分析產品。序列特異性引物應該與RNA的3’末端互補。如果RNA模板包含轉錄中斷，則使用隨機六聚體引物合成。
合成的第壹鏈cDNA序列是錯誤的。cDNA的重復合成。
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質量管理
通過使用聚腺苷酸化RNA轉錄物作為第壹鏈cDNA合成反應的對照模板(特異性對照引物，oligo(dT)18，隨機六聚體引物),檢測試劑盒中的所有試劑。。
質量驗證:Birute Gagiliene