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求賽默飛反向輔助第壹鏈cDNA合成試劑盒的中文說明。

中文如下:

RevertAid?第壹鏈cDNA合成試劑盒

(#K1621 10次)

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分析許可證

警告

建議第壹鏈cDNA的合成應在消除RNA酶汙染的條件下進行。移液管吸頭和試管必須用0.1% DEPC處理(在0.1%水溶液中浸泡過夜,在100℃加熱30分鐘,高壓滅菌)。強烈推薦戴手套。

重要!

儲存在-20℃下。

(如果對照RNA在-70℃長期保存)。

對照RNA避免了反復冷凍和解凍。將對照RNA融化並在冰上操作。

很多。:1210

參見包裝標簽了解保質期。

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該試劑盒設計用於從RNA模板制備全長第壹鏈cDNA。RevertAid?第壹鏈cDNA合成試劑盒依賴於壹種基因工程產品:莫洛尼小鼠白血病病毒逆轉錄酶(RevertAid?M-MuLV RT).這允許從長模板(最大13 kb)合成全長cDNA。RevertAid?由M-MuLV RT合成的第壹鏈cDNA的位置由不同的引物決定:

隨機六聚體引物:總RNA中的所有RNA都是RNA模板上非特異性位置的cDNA合成的模板。

Oligo(dT)18:在poly(A)+ mRNA的3’-末端。在這種情況下,只有帶有3’-聚腺苷酸尾的mRNA是cDNA合成的模板。

序列特異性引物:在引物結合位置。

由該系統合成的第壹鏈cDNA可用作PCR*模板。因為cDNA合成和PCR的反應條件是相同的,cDNA反應混合物可以直接加入到PCR混合物中。合成的第壹鏈cDNA也可以用作第二鏈合成的模板。放射性標記的DNA可以用作雜交探針。

具有3’-聚腺苷酸尾的1.1 kb RNA用作對照。

*PCR過程由Hoffmann-laroche公司負責。

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套件內容

1.RevertAid?M-MuLV逆轉錄酶(200u*/?l):

15?l酶溶於儲存緩沖液:50 mm tris-HCl (pH 8.3),0.1 m NaCl,1 mm EDTA,5 mm DTT,0.1% Triton?X-100和50%甘油。

2.核糖核酸?核糖核酸酶抑制因子(20u**/?l):

15?將酶溶解在儲存緩沖液中:20 mm hepes-NaOH (ph 7.5),50 mm NaCl,8 mm dtt,0.5 mm洗脫劑?清潔劑和50%甘油。

3.5x反應緩沖液:

100?15x反應緩沖液:250mm tris-HCl(25℃時pH 8.3),250 mm KCl,20 mm MgCl2,50 mm DTT。

4.10毫米dNTP混合物:

30?L 10mM dGTP,dATP,dTTP,dCTP水溶液。

5.寡核苷酸(dT)18引物:

15?l 0.5?g/?L (15A260單位/毫升)水溶液。

6.隨機六聚體引物:

15?l 0.2?g/?L (6A260單位/毫升)水溶液。

7.對照底漆:

15?l 10pmol/?l(1.7a 260單位/ml) 17聚體水溶液。

8.對照RNA:

15?L 1.1 kb 65438帶3'-poly(A)尾+0.1 kb RNA,0.5?g/?l .

9.DEPC處理水:

2 x 1.5毫升去離子水在amilili-q上?裝置中的去離子和DEPC處理。

*壹個單位RevertAid?M-mulvrt: 1納摩爾dTMP在37℃10分鐘與多核苷酸片段結合(吸附在DE-81中)。

* *壹個單位核糖核酸?RNA酶抑制劑:抑制5 ng RNase酶A活性50%。

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操作程序

1.合成適合PCR擴增的第壹條cDNA鏈。

①在冰上的試管中制備以下反應混合物:

模板RNA*:

總RNA 0.1-5微克。

或者poly (a)+RNA 10 ng-0.5 μ g。

或者特異性RNA 0.01pg-0.5μg g。

底漆:

寡核苷酸(dT)18引物(0.5微克/微升)1微升

或者隨機六聚體引物(0.2微克/微升)1微升。

或序列特異性引物15–20 pmol。

DEPC處理水至12微升

輕輕混合並離心3-5秒。

②將混合物在70°C下孵育5分鐘,用冰冷卻,短暫離心,收集沈澱物。

③將試管置於冰上,並按指定順序添加以下成分:

5倍反應緩沖液4微升

核糖核酸?核糖核酸酶抑制因子(20u/μl) 1μl

10毫米dNTP混合物2微升

輕輕混合,短暫離心,收集沈澱。

④在37℃孵育5分鐘(隨機六聚體引物在25℃孵育5分鐘)。

*反應所需的總RNA或poly(A)+ RNA的量取決於基因的表達水平。

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⑤加入RevertAid?M-MuLV逆轉錄酶(200 u/μ l) 1 μ l

最終體積為20微升

⑥將混合物在42°C下孵育60分鐘(隨機六聚體引物在25°C下孵育10分鐘,最後在42°C下孵育60分鐘)。

⑦在70℃下加熱65438±00分鐘以終止反應。又冷又冷。

合成的第壹鏈cDNA可直接用於PCR擴增。PCR可以用以下產品完成:

Taq DNA聚合酶(推薦)(# ep0401、# ep0402、# ep0403、# EP 0404);

Taq DNA聚合酶(天然的,不含BSA) (# ep0281、# ep0282、# ep0283、# EP 0284);

Taq DNA聚合酶(天然的,不含BSA) (# ep0071,# EP 0072);

2mM dNTP混合物(# r0241,# r 0242);

10毫米dNTP混合物(# r0191,# r0192)。

註意:

1.不需要首先從總RNA中分離出poly(A)+ RNA,但可以提高最終產物的產量和純度。

2.RNA樣本不能被基因組DNA汙染。

3.oligo(dT)18引物不需要優化條件,但根據反應中合成的cDNA平均長度,隨機六聚體引物與RNA的比例是嚴格的。增加六聚體/RNA的比例將導致更短(~500 bp) cDNA的更高產量,而降低該比例將導致更長的產物。

4.將反應溫度提高到45°C可以緩解富含GC mRNA的二級結構問題。

5.反應產物的分析(見第4章)cDNA需要[32P]放射性標記。為此加入RevertAid?加10μCi[?-32P]dNTP(例如dATP)加入到反應混合物中。加入1μl 0.5M EDTA終止反應,置於冰上。

6.合成的cDNA應儲存在-20℃下..

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2.合成適合第二鏈合成的第壹鏈cDNA。

①在冰上的試管中制備以下反應混合物:

模板RNA*:

聚腺苷酸+ RNA 1微克

或者特異性RNA 0.5-1 μ g。

底漆:

寡核苷酸(dT)18引物(0.5微克/微升)1微升

或者隨機六聚體引物(0.2微克/微升)1微升。

或序列特異性引物100pmol。

DEPC處理水至12微升

輕輕混合並離心3-5秒。

②將混合物在70°C下孵育5分鐘,用冰冷卻,短暫離心,收集沈澱物。

③將試管置於冰上,並按指定順序添加以下成分:

5倍反應緩沖液4微升

核糖核酸?核糖核酸酶抑制因子(20u/μl) 1μl

10毫米dNTP混合物2微升

輕輕混合,短暫離心,收集沈澱。

④在37℃孵育5分鐘(隨機六聚體引物在25℃孵育5分鐘)。

⑤加入RevertAid?M-MuLV逆轉錄酶(200 u/μ l) 1 μ l

最終體積為20微升

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⑥將混合物在42°C下孵育60分鐘(隨機六聚體引物在25°C下孵育10分鐘,最後在42°C下孵育60分鐘)。

⑦在70℃下加熱65438±00分鐘以終止反應。又冷又冷。

合成的第壹鏈cDNA可用於第二鏈合成。可以用下列產品完成合成:

DNA聚合酶I (#EP0041,# EP 0042);

T4 DNA連接酶(# el0014,# el0011,# El 0012);

核糖核酸酶H (#EN0201,# EN0202);

核酸酶S1 (#EN0321)。

筆記

1.為了提高合成的特異性和效率,poly(A)+片段必須從總細胞RNA中分離出來。

2.oligo(dT)18引物不需要優化條件,但根據反應中合成的cDNA平均長度,隨機六聚體引物與RNA的比例是嚴格的。增加六聚體/RNA的比例將導致更短(~500 bp) cDNA的更高產量,而降低該比例將導致更長的產物。

3.將反應溫度提高到45°C可以緩解富含GC mRNA的二級結構問題。

4.反應產物的分析(見第4章)cDNA需要[32P]放射性標記。為此加入RevertAid?加10μCi[?-32P]dNTP(例如dATP)加入到反應混合物中。加入1μl 0.5M EDTA終止反應,置於冰上。

5.合成的cDNA應儲存在-20℃下..。

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3.合成具有高比放射性的第壹鏈

①在冰上的試管中制備以下反應混合物:

模板RNA*:

聚腺苷酸+ RNA 0.5微克

底漆:

寡核苷酸(dT)18引物(0.5微克/微升)1微升

或者隨機六聚體引物(0.2微克/微升)1.5微升。

或序列特異性引物100pmol。

DEPC處理水至8μl

輕輕混合並離心3-5秒。

②將混合物在70°C下孵育5分鐘,用冰冷卻,短暫離心,收集沈澱物。

③將試管置於冰上,並按指定順序添加以下成分:

5倍反應緩沖液4微升

核糖核酸?核糖核酸酶抑制因子(20u/μl) 1μl

10毫米dGTP,dCTP,dTTP混合物1微升

0.1毫米dATP* 4微升

輕輕混合,短暫離心,收集沈澱。

④在37℃孵育5分鐘(隨機六聚體引物在25℃孵育5分鐘)。

⑤加入:

[?-32P]dATP(10毫微克/毫升)1微升

RevertAid?M-MuLV逆轉錄酶(200u/μl) 1μl

最終體積為20微升

*本套件中不包括單獨的dNTP解決方案。使用dNTP集合(#R0181)進行合成。。

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⑥將混合物在42°C下孵育60分鐘(隨機六聚體引物在25°C下孵育10分鐘,最後在42°C下孵育60分鐘)。

⑦加入5μl 0.5m EDTA終止反應。

⑧如有必要,加入等體積(25 μ l)的0.6N NaOH水解RNA,並在70°C下孵育30分鐘。

⑨在Sephadex?通過G-50柱層析去除未結合的dNTPs。

具有高比活性(>:107 dpm/μg)的第壹鏈cDNA可用作Southern雜交探針。

註意:

為了獲得比活性更高(超過108dpm/μg)的cDNA,100μCi的[?向反應混合物中加入-32P]dATP。如果最終反應體系大於20μl,10μl [?-32P]dATP (10mCi/ml)並將制備的反應混合物轉移至該試管中(5步)。然後繼續合成。

4.分析第壹鏈cDNA產物。

堿性瓊脂糖凝膠電泳只能鑒定或分析放射性標記的cDNA產物。

確定第壹條cDNA鏈的產量。

①將1μl樣品點至兩片DE-81濾膜(1.5x1.5cm)。

(2)烤燈烘幹濾膜。保留壹個濾膜,直接用它來測定樣品的總放射性。

③另壹濾膜沖洗5min10ml 7.5%(w/v)na 2 hpo 4x 12H2O 5分鐘三次;用水、丙酮或96%乙醇沖洗。

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(4)烤燈烘幹清洗後的濾膜。

⑤將兩個濾膜(未清洗和清洗過的)轉移到放射性計數器中,並進行計數。

⑥用下列公式計算第壹條cDNA鏈的產量:

如果dNTP的最終濃度為1.0mM,則(20μl)中的dATP摩爾數為2x10-8摩爾。標記的dATP數量相當少,可以忽略。然而,在具有高比活性的cDNA的情況下(第3章),未標記的dATP的最終濃度為0.02 mm..為了計算測量中的摩爾dATP,有必要將未標記摩爾和標記摩爾相加。

MW是核酸的平均分子量,等於333x106 μg/mol。因為四個dNTP都參與反應,所以MW乘以4。

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例如:例如:

如果洗過的濾膜產生4x104dpm,未洗過的濾膜產生1.8x 106 DPM;

所以:

cDNA產量(μg)= 4x 104 DPM x(2x 10-8mol dATP)x 4x(333 x 106μg/mol)= 0.59μg

1.8x106dpm

cDNA產量% = 0.59微克x 100% = 59%

1微克

堿性瓊脂糖凝膠電泳分析

用[32P]標記的第壹鏈cDNA的合成產物可以通過堿性瓊脂糖凝膠電泳進行分析。類似地,合成產物和所用的DNA標記物都應該用[32P]標記。

①制備1.4%瓊脂糖凝膠(30mM NaCl,2mM EDTA),在堿性電泳緩沖液(30mM NaOH,2mM EDTA)中平衡至少1h。

②樣品(1x105 dpm),轉移到壹個單獨的試管中,並用5μl水稀釋。添加5μl 2x加載緩沖液。

(60mM NaOH,2mM EDTA,6% Ficoll?400,0.05%溴酚藍)。標記的DNA標記應該用相同的2x加載緩沖液稀釋。

註意2x上樣緩沖液應保持在-20°C,或者在使用前加入染料。

(3)加入樣品並在堿性瓊脂糖凝膠中以5V/cm進行電泳,直到染料遷移到接近凝膠2/3的位置。

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④凝膠在室溫下浸泡在7%三氯乙酸(TCA)中30分鐘。

⑤凝膠在凝膠幹燥機上真空幹燥或在玻璃板壓制的多層紙巾下幹燥1-2小時。

⑥用塑料蓋蓋住幹燥的凝膠,將x光膠片在室溫下曝光過夜。

控制綜合

提供具有3’-聚腺苷酸尾的1.1 kb RNA作為對照。

①在冰上的試管中制備以下反應混合物:

模板RNA*:

對照RNA 0.5微克

底漆:

寡核苷酸(dT)18引物(0.5微克/微升)1微升

或者隨機六聚體引物(0.2微克/微升)1微升。

或對照(序列特異性)引物(10 pmol) 2 μ l

DEPC處理水至11μl

輕輕混合並離心3-5秒。

②將混合物在70°C下孵育5分鐘,用冰冷卻,短暫離心,收集沈澱物。

③將試管置於冰上,並按指定順序添加以下成分:

5倍反應緩沖液4微升

10毫米dNTP混合物2微升

核糖核酸?核糖核酸酶抑制因子(20u/μl) 1μl

輕輕混合,短暫離心,收集沈澱。

④在37℃孵育5分鐘(隨機六聚體引物在25℃孵育5分鐘)。

⑤加入:

[?-32P]dATP(10毫微克/毫升)1微升

RevertAid?M-MuLV逆轉錄酶(200u/μl) 1μl

最終體積為20微升

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⑥將混合物在42°C下孵育60分鐘(隨機六聚體引物在25°C下孵育10分鐘,最後在42°C下孵育60分鐘)。

⑦加入1μl 0.5M EDTA終止反應,置於冰上。

⑧分析產品(見第4章)。

註意:

1.當使用對照RNA時,第壹鏈cDNA的產量通常超過50%。

2.如果對照用寡(dT)18或對照(序列特異性)引物合成,可以觀察到1.1 kb的清晰條帶。如果使用隨機六聚體引物,通常可以觀察到幾條短帶。

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常見問題

低產率和檢測不到產物是逆轉錄酶反應失敗的兩個明顯標誌。

可能的原因檢查和補救

DNA模板降解。乙二醛和甲醛凝膠電泳檢測RNA模板的完整性。對照RNA在凝膠中應具有1.1kb的亮帶。處理樣本RNA時,註意不要被RNA酶汙染。將模板RNA和對照RNA保存在-70°C,避免樣品反復凍融,融化後放在冰上。

核糖核酸酶汙染了反應混合物。使用對照並分析所得產物(參見對照的合成)。在無菌條件下制備反應混合物,始終戴手套,並用DEPC處理所有與樣品接觸的器具。主要是不汙染溶液。

RevertAid?M-MuLV逆轉錄酶抑制劑(SDS、EDTA、胍鹽、磷酸鹽、焦磷酸鹽、多胺、精胺、亞精胺)。將1μg對照RNA混入RNA樣品中,同時合成。如果使用oligo(dT)18或對照引物,合成的產率應該在50%以上,並且可以看到1.1kb的明亮的附加帶。用96%乙醇沈澱RNA樣品,並用75%乙醇洗滌(應使用DEPC處理過的水制備乙醇溶液)。不要向反應混合物中添加抑制劑。

不正確的引物與其他引物壹起用於分析產品。序列特異性引物應該與RNA的3’末端互補。如果RNA模板包含轉錄中斷,則使用隨機六聚體引物合成。

合成的第壹鏈cDNA序列是錯誤的。cDNA的重復合成。

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質量管理

通過使用聚腺苷酸化RNA轉錄物作為第壹鏈cDNA合成反應的對照模板(特異性對照引物,oligo(dT)18,隨機六聚體引物),檢測試劑盒中的所有試劑。。

質量驗證:Birute Gagiliene

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