肌苷，輔酶Q10和硫辛酸對線粒體疾病的有益作用
作 者M Christine Rodriguez;Jay R MacDonald;Douglas J Mahoney;Gianni Parise;M Flint Beal;Mark A Tarnopolsky
刊 名Muscle & nerve
出版日期2007
卷 號Vol.35
頁 碼235-242
doi10.1002/mus.20688
影響因子2.456（2007）? 2.283（2015）
摘要： 線粒體疾病具有***同的細胞後果：（1）ATP產生減少；（2）增加對替代厭氧能源的依賴；（3）增加活性氧的產生。本研究的目的是確定聯合治療的效果（肌酸壹水合物，輔酶Q?10，以及針對上述細胞後果的硫辛酸，使用線粒體細胞病患者的隨機，雙盲，安慰劑對照，交叉研究設計，針對多個結果變量。 3例患有線粒體腦病，乳酸性酸中毒和中風樣發作（MELAS），4例存在線粒體DNA缺失（3例慢性進行性眼外肌麻痹患者和1例Kearns-Sayre綜合征患者），還有9例其他非線粒體疾病分為前兩組。 聯合療法可降低所有患者組的靜息血漿乳酸和尿8-異前列腺素，並減輕峰值踝背屈強度的下降，而僅MELAS組觀察到較高的無脂肪量。壹起，這些結果表明，針對線粒體功能障礙的多個最終***同途徑的聯合療法可有利地影響細胞能量功能障礙的替代標誌物。將來需要在相對均壹的人群中進行更大樣本量的研究，以確定這種聯合療法是否影響功能和生活質量。
線粒體疾病代表壹組影響線粒體能量傳導的疾病，其特征是臨床，生化和遺傳異質性。 18 盡管表型表達差異很大，但大多數患者合並有乳酸性酸中毒，中風或癲癇發作，頭痛，色素性視網膜炎，上瞼下垂，運動耐力低下，眼肌麻痹，心肌病，神經病和視力減退。 16 ， 29 ， 38
線粒體功能障礙導致許多細胞後果，包括：（1）ATP生成減少；（2）增加對替代厭氧能源的依賴；（3）增加活性氧（ROS）的產生。 16 ， 37 沒有療效的治療線粒體疾病，大多數策略的目的是為了緩解上述蜂窩後果。 16 ， 18 上的患者的線粒體疾病的治療策略的報告已經檢查的單壹化合物的效果，如輔酶Q?10（輔酶Q?10） 2 ， 4 ， 21 或肌酸（CRM）。 13 ， ?14 ， ?38 基於的概念，即線粒體功能障礙導致壹些細胞的病理生理學後果， ?33個 為線粒體疾病大多數治療策略具有相對於單壹療法使用的聯合治療（或治療“雞尾酒”）。某些研究已經評估了針對上述三種方法中的壹種以上的聯合療法的療效。然而，這些是任何壹種情況下報告， ?8 ， ?25次 開放試驗中， ?1 ， ?19 ， ?20 ， ?27 ， ?32 或回顧性研究。 26
基於線粒體疾病人體試驗的潛在功效證據或人體試驗或體外研究的證據顯示擬議的化合物可以緩解線粒體功能障礙的壹種或多種最終常見途徑，我們建議評估聯合用藥的潛在療效下列化合物：（1）CrM（替代能源 36 和抗氧化劑 30 ）； （2）α-硫辛酸（抗氧化劑 17 和可增加CrM的吸收 6 ） ；（3）輔酶Q?10?[作為抗氧化劑 21 並繞過電子傳輸鏈（ETC） 19的配合 物I ]。我們在這裏報告了壹項隨機，雙盲，安慰劑對照，交叉試驗的結果，該試驗研究了這種靶向聯合治療性雞尾酒聯合CrM，CoQ?10和α-硫辛酸對線粒體細胞病變患者的影響。
患者： 從麥克馬斯特大學的神經肌肉和神經代謝診所招募了17位具有明確或可能的線粒體疾病的患者。結合臨床癥狀，空腹血清乳酸濃度，肌肉活檢結果（紅色的纖維狀或細胞色素 c 氧化酶陰性纖維）和線粒體DNA（mtDNA）分析。僅8、9和13號患者未鑒定出DNA突變，對於線粒體神經胃腸道腦病的患者，僅進行確認試驗（胸苷升高，胸苷磷酸化酶活性降低）；然而，他們的乳酸濃度升高，組織學異常，運動耐力低下，有氧能力低，被認為具有“可能的線粒體細胞病變”。壹名患者由於個人原因未完成研究的壹部分；因此，該患者的數據被排除在分析之外。最終分析基於16位患者（10位女性和6位男性），根據他們的診斷分為三組。表中顯示了患者人群的特征 1 。 第壹組包括三位線粒體腦病，乳酸性酸中毒和中風樣發作的患者（MELAS組）。第二組包括三名被診斷為慢性進行性眼外肌麻痹（CPEO）的患者和壹名被診斷為Kearns-Sayre綜合征（KSS）的患者，所有患者均在肌肉來源的mtDNA中被檢測出缺失（CPEO / KSS組）。第三組包括各種線粒體疾病的患者：六名線粒體細胞病變患者，兩名Leber遺傳性視神經病變患者和壹名線粒體神經胃腸道腦病患者（其他組） 。該研究獲得了我們機構倫理委員會的道德批準，所有患者均提供了知情的書面同意。
CPEO，慢性進行性眼外肌麻痹；細胞病變，線粒體細胞病變；KSS，Kearns–Sayre綜合征；LHON，Leber的遺傳性視神經病變；MELAS，線粒體腦病，乳酸性酸中毒和中風樣發作；MNGIE，線粒體神經胃腸道腦病（無胸苷磷酸化酶活性，胸腺嘧啶核苷水平高）。
設計/幹預。
患者參加了壹項隨機，雙盲，安慰劑對照，交叉研究，其中每個參與者均接受了2個月的治療和安慰劑治療，兩次試驗之間有5周的清除期。治療階段包括3 g CrM + 2 g葡萄糖+調味劑（新堿；加利福尼亞州帕洛阿爾托的Avicena），300 mgα-硫辛酸（Tishcon，Westbury，紐約）和120 mg CoQ?10（Qgel； Tishcon）每天的0：900和21:00。在安慰劑階段，將外觀相同，品嘗相同的粉末（5 g葡萄糖+調味劑； Avicena）和凝膠膠囊（大豆油； Tishcon）用作安慰劑。
禁食4小時後，兩個試驗的患者在大約每天同壹時間（2-3小時內）在每個幹預階段之前和之後完成測試。
測量。
僅在首次訪問時記錄參與者的身高和體重。所有其他訪視均采取了其他所有結果指標。參與者使用定制的力傳感器設備進行了握力，踝背屈（關節角度為90°）和膝蓋伸展強度測試，數據已直接輸入包含數據采集和分析軟件的計算機中，如前所述。 38 對於所有力量測量，參與者都在右側進行測試，並根據手的大小進行個性化設置，並在每次訪問之間保持恒定。為了達到峰值強度，參與者進行了3個5s試驗，相隔約30 s。記錄具有最佳結果的試驗值。參與者還進行了1分鐘的等距握力和踝背屈疲勞測試（9秒鐘工作時間：1秒鐘休息周期）。使用肺活量計（Koko； PDS Instrumentation，路易斯維爾，科羅拉多州）進行肺功能測試，包括1秒內的強制肺活量和強制呼氣量。每位患者每次訪視均至少完成兩次肺活量測定，以確保該值與他們的首次嘗試壹致。進行生物電阻抗（Prism BIA 101A； RJL Systems，Clinton Twp，密歇根州）以確定身體成分。
靜脈血液采樣和尿液采集。
從肘前靜脈將全血收集到預先冷卻的，裝有肝素（用於乳酸分析）或EDTA（用於測定CoQ?10）的真空管中，並以2500 rpm離心10分鐘。將血漿儲存在-80℃。每位患者都提供了尿液樣本樣品，將其約10 ml快速冷凍並保存在-80°C下用於肌酸，肌酐，8-羥基-2'-脫氧鳥苷（8-OHdG）和8-異前列腺素的後續分析（ 8-IsoP）。
乳酸
使用YSI 2300 Stat Plus乳酸分析儀（YSI，Yellow Springs，俄亥俄州）測定血漿乳酸濃度。乳酸的批內和批內變異系數分別為2.1％和1.7％。
輔酶Q?10。
使用電化學檢測器通過高效液相色譜（HPLC）測定血漿CoQ?10濃度。將血漿（0.5 ml）等分到裝有1 ml 1-丙醇和0.5 ml輔酶Q?9的10 ml真空容器中，混合5分鐘，然後在300? g下 離心5分鐘。使用0.22μM註射器過濾器過濾樣品，然後將其轉移到色譜瓶中，以進行HPLC直接分析。將輔酶Q?9添加到混合物中以作為內標，作為輔酶Q?9的水平在人體血液中微不足道。將所得樣品註入裝有3μm填料的反相不銹鋼色譜柱（150×3 mm）RP‐C18中，該色譜柱帶有壹個電化學檢測器（ESA，貝德福德，馬薩諸塞州），該檢測器連接到帶有單個電極的保衛室（5020型） ； E = +350 mV）和帶有雙電極的庫侖分析池（5011型； E1 = -400 mV，E2 = +300 mV）。使用混合和脫氣的甲醇，1-丙醇和乙醇（70:20:10）的流動相，其中含有50 mM乙酸鋰作為電導鹽，流速為0.5 ml / min，總運行時間少於15分鐘?首先通過還原泛醌（E = -400 mV），然後氧化所得泛醇（E = +300 mV）測量輔酶Q?10。輔酶Q?10和輔酶Q?10?H?2在最後壹個電極上以最高靈敏度檢測到。標準曲線的相關系數為0.997。變異系數確定為<2％。
肌酸和肌酐。
使用HPLC測定尿液中的肌酸濃度，肌酐和肌酸：肌酐的比例。將尿液（1 ml）等分到微量離心管中，並以10,000 rpm離心10分鐘。使用ddH?2?O?將尿液上清液稀釋至十分之壹稀釋（0.1 ml上清液至0.9 ml ddH?2O）。使用冷藏自動進樣器將稀釋的尿液上清液保持在10°C。使用Hewlett Packard LC1100系列HPLC（Agilent，Mississauga，Ontario），將紫外檢測器設置為λ= 210 nm，將樣品註入250×4.6 mm C18 Phenomenex10-μHydro-RP 80色譜柱中。Hewlett Packard LC1100數據分析程序會生成校準曲線並分析所得數據。流動相是使用氫氧化鉀以1.0 ml / min的流速將磷酸二氫鉀（20 mM）調節至pH 5.0。變異系數為3.1％。
8-IsoP。
按照制造商的說明，使用商業酶聯免疫吸附測定法（MediCorp，蒙特利爾，魁北克）測定尿中的8-IsoP濃度。標準曲線的相關系數為0.988。變異系數為10.5％。8-IsoP值相對於肌酐（g）表示。
8-OHdG。
如前所述，使用HPLC測定尿液中8-OHdG的濃度。 3 ?8-OHdG值相對於肌酐（g）表示。
統計。
使用三向（組×處理×時間）或雙向（組×處理）重復測量方差分析（ANOVA）進行統計分析。鑒於先前的假設，即由於三種成分中的每壹種都具有抗氧化特性，因此聯合療法可減少乳酸鹽並降低氧化應激，我們對氧化應激標誌物使用了單尾檢驗。當發現重要結果時，將運行Tukey HSD事後測試。所有分析均使用Statistica v。5軟件（StatSoft，Tulsa，俄克拉荷馬州）進行。 P ?<0.05的值被認為具有統計學意義。所有數據均以平均值±SD給出。
輔酶Q?10和肌酸：肌酸酐。
如預期的那樣，與安慰劑階段相比，聯合治療的血漿輔酶Q?10和尿肌酸：肌酐的比率明顯更高。聯合治療後（1.94±0.89μg/ ml）的血漿CoQ?10濃度比安慰劑（0.71±0.24μg/ ml）高172％（ P ?<0.05;? n ?= 14），肌酸：肌酐比高600％ （2.45±2.08）比安慰劑（0.35±0.20）（ P <0.05）。
血漿乳酸鹽。
在血漿乳酸中發現顯著的治療×時間相互作用（ P ?<0.05，單尾），在聯合治療階段血漿乳酸濃度較低，在安慰劑階段未觀察到效果（圖 1 ）。
*? P ?<0.05，單尾。COMB，聯合療法；CPEO，慢性進行性眼外肌麻痹；KSS，Kearns–Sayre綜合征；MELAS，線粒體腦病，乳酸性酸中毒和中風樣發作。黑柱，聯合療法；開列，安慰劑。
觀察到FFM，TBW和％BF的顯著三向相互作用（組×治療×時間）（ P ?<0.05）（圖 2 ），FFM和TBW升高，％BF降低僅對MELAS集團。
（A） 三組中每個治療階段之前和之後的無脂質量（FFM）， （B） 全身水（TBW）和 （C） 身體脂肪百分比（％BF）。*? P ?<0.05；**? P ?<0.05，單尾。COMB，聯合療法；CPEO，慢性進行性眼外肌麻痹；KSS，Kearns–Sayre綜合征；MELAS，線粒體腦病，乳酸性酸中毒和中風樣發作。黑柱，聯合療法；開列，安慰劑。
肺功能。
在1 s內未觀察到治療，組或時間對強制肺活量或強制呼氣量的影響（表 2 ）。
表2.?肺功能（ n ?= 11）。
CPEO，慢性進行性眼外肌麻痹；FEV?1，用力呼氣量1 s；FVC，強制肺活量；KSS，Kearns–Sayre綜合征；MELAS，線粒體腦病，乳酸性酸中毒和中風樣發作。
強度措施。
盡管對於每個階段的結束，無論采用何種治療方法，峰值握力都降低的趨勢不明顯（ P ?= 0.054），但對於峰值握力的處理，組別或時間均無影響。對於握把或腳踝背屈疲勞（表示為峰值疲勞或區域疲勞）或峰值伸膝力量，也沒有任何治療，組或時間效應。但是，觀察到踝背屈峰值強度存在顯著的雙向相互作用（治療×時間），安慰劑後，踝背屈峰值強度顯著下降（從31.16±13.68 Nm降至29.06±13.31 Nm），但未觀察到組合治療（從29.32±13.78 Nm到29.31±12.05 Nm）（ P <0.05， n ?= 16）。
尿液8-OHdG和8-IsoP。
尿8-OHdG沒有治療或組作用；然而，與安慰劑相比，聯合治療後降低8-OHdG /肌酐的趨勢無統計學意義（分別為3,472.05±1,883.06 ng / g肌酐與4,165±1,985.00 ng / g肌酐； P ?= 0.065）。觀察到8-IsoP的治療效果，因此與安慰劑相比較，聯合治療後觀察到較低的尿8-IsoP /肌酐含量（分別為6,572.47±3,356.64 ng / g肌酐與7,463.43±3,155.23 ng / g肌酐。 ； P ＜0.05）。
CrM，CoQ?10和硫辛酸 的聯合治療 可降低靜息乳酸濃度，防止峰值踝背屈強度降低和氧化應激降低，這可通過尿中8-IsoP排泄和尿液的顯著減少來體現。 所有組中8-OHdG排泄的方向性趨勢。此外，在MELAS組中，患者的身體成分發生了積極變化（FFM和TBW增加，％BF降低）。聯合療法對肺功能，峰值握力或膝蓋伸展力量，或握力或腳踝背屈百分比或區域疲勞沒有影響。
從突變線粒體疾病的結果導致在氧化磷酸化的缺陷，導致在nonaerobic能源的依賴性增加 16 ， 38 和壹個升高的血漿乳酸濃度。 16 ， 29 ， 38 無論是磷酸肌酸（PCR）系統，腺苷酸激酶/ AMP脫氨酶，或糖酵解/糖原分解可以被用來提供ATP;?但是，由於對糖酵解/糖酵解的依賴性增加，導致乳酸升高 38 CrM被包括在本研究中用於增強PCr系統的聯合治療中。聯合治療後尿肌酸：肌酐的升高和血漿乳酸濃度的降低間接表明聯合治療中的CrM成分可能為肌肉收縮提供了另壹種厭氧能源。
從線粒體疾病患者的肌肉中觀察到總肌酸 36 和PCr? 14的 水平較低，進壹步支持了在此類患者中補充CrM的潛在益處。Kornblum等人的最新研究。 14 研究了補充CrM對CPEO或KSS患者肌內PCr的影響。相反，先前在健康受試者中，觀察到的結果 6 ， 11 沒有導致CrM工作在補充盡管肌酸的血漿濃度顯著隨著由磷- 31核磁***振光譜法測量增加肌內肌酸濃度。 14 當前研究的局限性在於未在大腦或骨骼肌中測量肌酸或PCr含量。然而，伯克等。 6 表明，在健康誌願者中，將CrM與硫辛酸聯合使用時，肌肉PCr和總肌酸濃度顯著高於單獨補充CrM時。 因此，硫辛酸在我們的患者中可能會增加CrM的攝取，從而導致觀察到的靜息血漿乳酸濃度降低。
乳酸濃度較低的另壹種或其他解釋可能是聯合治療改善了線粒體ATP的產生。輔酶Q?10是ETC中的電子受體，它將電子從絡合物I和II轉移到絡合物III。 16 ， 18 ， 33 的CoQ的目標10的補充是旁路缺陷在ETC最大化ATP產生。 16 壹項使用來自線粒體細胞病變患者的培養淋巴細胞的研究發現，結合CoQ?10的聯合療法可增加線粒體ATP的產生，其中約49％歸因於CoQ?10。 19 相比之下，人類研究的結果不是決定性的，對於壹些報道報道輔酶Q的有益效果10在降低血漿休息乳酸濃度患者的線粒體疾病， 1 ， 2 ，而另壹些則沒有。 19 ， 20 ， 38 不同於以往的報道中，病人在我們的研究也給予硫辛酸。 硫辛酸天然存在於線粒體內，是丙酮酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶的重要輔助因子。 33 硫辛酸用作有效的抗氧化劑 31 ， 33 ，並且降低氧化應激在健康誌願者的標記。 17 硫辛酸對ROS的清除作用增加，可能會減慢線粒體疾病中的“惡性循環”，在這種情況下，ROS的產生會導致mtDNA突變，從而加劇氧化磷酸化的缺陷，從而導致更多的ROS產生 。 16 因此， 輔酶Q?10與硫辛酸結合使用，可能具有增加ATP產生的能力，從而導致替代能源的利用率下降，血漿血漿乳酸濃度降低。
安慰劑治療後，聯合療法減輕了峰值踝背屈強度的下降。據推測，在聯合治療CRM的成分會導致與安慰劑相比改進的強度值，如CRM有被證實可以改善患者強度與線粒體疾病 35 ， 38 或杜氏肌營養不良癥， 34 和中老年健康誌願者。 5 鑒於我們沒有直接測量肌肉中的肌酸或PCr含量，因此我們不能得出結論說聯合療法中的CrM成分會導致踝背屈峰值強度下降。其他研究表明，使用CoQ可以改善線粒體疾病患者的強度10補充。 4 ， 9
先前的研究表明，補充CrM可以改善人體成分。 5 ， 34 的MELAS組在體本研究中證實的改善的組合物，增加FFM和TBW，和降低的％BF-以下組合療法;?但是，CPEO / KSS或其他組的患者未見這些改善。與本研究其他兩組中代表的其他形式的線粒體疾病患者相比，MELAS患者表現出更嚴重的臨床表型。因此，患有MELAS的患者在本研究中測量的所有變量（包括身體組成）方面都有更大的改善空間。
高水平的ROS和氧化應激與線粒體疾病的病理生理有關。氧化應激的更高水平已報告患者的線粒體疾病與對照組相比 21 ， 39 和患者的線粒體DNA突變更高程度的異質性。 7 聯合療法中的所有三種化合物均具有降低氧化應激的特性。 肌酸在無細胞系統中具有直接的抗氧化特性 15， 並為與多種氧化劑孵育的哺乳動物細胞提供細胞保護作用。 30 輔酶Q?10充當脂質的抗氧化劑和線粒體膜 10 ， 33 並且還可以通過繞過氧化磷酸化中的缺陷來減少ETC的電子泄漏。 10 最後， 補充硫辛酸後，健康誌願者的尿中異前列腺素水平較低 。 17 我們觀察到，與安慰劑相比，聯合治療後的8-IsoP濃度更低；但是，僅觀察到了8-OHdG含量降低的趨勢。異前列腺素是由花生四烯酸的過氧化作用形成的類似於前列腺素的化合物。 22 ?-? 24 它們是化學穩定的，在體內形成的，並且是壹個過氧化特異性產物可檢測在穩態水平在多種人類組織和體液中的 24 ;? 所有這些特征都使8-IsoP被認為是評估體內氧化應激的最可靠標記。 23 ， 24 的8-OHdG由鳥苷殘基的羥基化形成，並且經常被用來作為對DNA損傷ROS的生物標誌物。 28 ， 39 由於的8-OHdG是用於向所有的DNA，不僅線粒體DNA的氧化損傷的生物標記物，它是可能的核DNA的存在可能掩蓋或稀釋用於降低氧化性損傷的mtDNA的聯合治療的有益效果。
很少有隨機對照試驗檢查了營養藥物在線粒體疾病患者中的作用。那些已經進行了嚴格的檢查，單壹化合物的唯壹的效果，如CRM的 12 ， 13 ， 38 或輔酶Q?10， 9 已審查。其他的研究，審查的聯合治療效果 1 ， 19 ， 20 ， 26 ， 27 ， 32 沒有使用與我們的研究相同的嚴格研究設計。結果，與這些研究進行直接比較非常困難，特別是當結合不同線粒體疾病人群中檢查了不同的化合物，組合和結果指標這壹事實時。考慮到幾乎無限的組合，在將來進行臨床試驗評估之前，必須采用多種篩選方法，基於合理的首要原則測試潛在療法。方法論，例如使用轉基因動物模型或雜種動物，可能被證明可用於評估“線粒體混合物”中目前使用的十幾種化合物的許多潛在組合。
我們的結果表明，與安慰劑相比， 針對線粒體功能障礙的三種後果的CrM，CoQ?10和硫辛酸的聯合療法可改善靜息血漿乳酸濃度，身體成分，踝背屈強度和氧化應激。 但是，由於壹個患者組比其他患者具有更大的獲益 （MELAS> CPEO / KSS =其他） ，因此壹種治療策略可能並不普遍適用於所有線粒體疾病。
這項研究由沃倫·拉默特（Warren Lammert）及其家人慷慨捐贈。輔助酶Q?10和硫辛酸由Tishcon捐贈，肌酸壹水合物由Avicena捐贈。
8-IsoP，8-異前列腺素;?8-OHdG，8-羥基-2'-脫氧鳥苷;?％BF，身體脂肪百分比；輔酶Q?10，輔酶Q?10?;?CPEO，慢性進行性眼外肌麻痹；CrM，肌酸壹水合物；ETC，電子傳輸鏈；FFM，無脂肪物質；HPLC高效液相色譜；KSS，Kearns–Sayre綜合征；MELAS，線粒體腦病，乳酸性酸中毒和中風樣發作；mtDNA，線粒體DNA；PCr，磷酸肌酸；ROS，活性氧；TBW，全身水
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