高效液相色譜原理高效液相色譜的應用及原理分析
高效液相色譜法是分離、分析和純化有機化合物(包括通過化學反應可以轉化為有機化合物的無機物)的有效方法之壹。
約80%的已知有機化合物可通過高效液相色譜進行分離分析，且該方法條件溫和，對樣品無損傷，特別適用於沸點高、難氣化揮發、熱穩定性差的有機化合物和生物物質。HPLC系統壹般由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、數據記錄和處理裝置等組成。
輸液泵、色譜柱和檢測器是關鍵部件。壹些儀器包括梯度洗脫裝置、在線脫氣器、自動進樣器、柱或保護、柱溫度控制器等。現代HPLC儀器還具有微機控制系統，用於儀器自動控制和數據處理。
制備型HPLC儀器還配備有自動餾分收集裝置。目前，國外常見的HPLC儀器生產廠家有Waters公司、Agilent公司(原HP公司)和Shimadzu公司，國內有上海五豐科學儀器有限公司、上海何工科學儀器有限公司、大連益園Jung Su公司、北京創新通恒公司和北京文分公司。
壹、輸液泵1。泵的結構和性能輸液泵是HPLC系統中最重要的組件之壹。泵的性能直接影響整體質量和分析結果的可靠性。
輸液泵應具有以下性能:①流量穩定，其RSD應小於0.5%，這關系到定性定量分析的準確性；(2)流量範圍寬，分析型應在0.1~10ml/min範圍內連續調節，制備型應達到100ml/min；③輸出壓力高，壹般應達到150 ~ 300 kg/cm2: ④液壓缸體積小；⑤良好的密封性能和耐腐蝕性能。泵的種類很多，根據輸液的性質可以分為恒壓泵和恒流泵。
恒流泵可分為螺旋噴射泵、柱塞往復泵和往復泵。恒壓泵受柱陰影響，流量不穩定；螺桿泵氣缸太大，這兩個泵已經淘汰了。目前，應用最廣泛的是柱塞往復泵。
柱塞往復泵的液缸體積小，可達0.1ml，便於清洗和更換流動相，特別適用於再循環和梯度洗脫。改變電機轉速可以方便地調節流量，流量不受柱壓影響；泵壓可達400公斤/CM2。ADW的主要缺點是輸出脈沖大，現在用雙泵浦系統克服了。
根據連接方式，雙泵可分為並聯式和串聯式。壹般來說，並聯泵的流量再現性較好(RSD約為0.1%，串聯泵為0.2~0.3%)，但故障幾率較大(因為止回閥較多)，價格也較貴。二、進樣器的壹般HPLC分析常用的六通進樣閥(美國RHEODYNE公司的7725和7725I型最常見)，其關鍵部件由壹個圓形密封墊(轉子)和壹個固定底座(定子)組成。
耐壓高(35~40MPA)，進樣準確，重復性好(0.5%)，操作方便。六通閥取樣方法有兩種:部分填充法和完全填充法。
(1)用部分充液法進樣時，進樣體積應不超過定量環體積的50%(最多75%)，每次進樣的體積應準確且相同。該方法的準確性和重復性取決於進樣器進樣的熟練程度，且容易產生進樣引起的峰展寬。
(2)采用完全充液法進樣時，進樣體積應不小於定量環體積的5~10倍9或至少3倍，以完全取代定量環的內相與流動相，消除管壁效應，保證進樣的準確性和重復性。3.柱色譜是分離分析的手段，分離是核心，所以負責分離的柱子是色譜系統的心臟。
對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好、分析速度快。多孔矽膠、基於矽膠的結合相、氧化鋁、有機聚合物微球(包括離子交換樹脂)、多孔碳等。可商購用於HPLC，通常具有3，5，7，654，38±00 μm等粒度。，柱效理論值可達5160000/m..
壹般分析只需要5000塊塔板的柱效；對於同系物分析，只要500；對於較難分離的物質，可以使用高達20000的柱，所以壹般約10 ~ 30cm的柱長就可以滿足復雜混合物分析的需要。柱效受柱內外因素的影響。為了達到塔的最佳效率，除了塔外死體積要小之外，不應該有合理的塔結構(盡可能減少填料床外死體積)和填料技術。
即使采用最好的填料技術，塔中心和沿管壁的填料情況也總是不同的。靠近管壁部分疏松，易產生溝流，流速快，影響沖洗劑的歧管，使譜帶變寬。這就是管壁效應。該管壁面積大約是從管壁向內的材料直徑厚度的30倍。
在壹般的液相色譜系統中，柱外效應對柱效率的影響遠大於管壁效應。四、檢測器HPLC檢測器分為兩類:通用檢測器和專用檢測器。
1.通用檢測器可以連續測量色譜柱流出液的所有特征變化，通常采用差分測量方法。這類檢測器包括示差折光檢測器、介電常數檢測器、電導率檢測器等。萬能檢測器應用範圍廣，但因其對流動相的響應易受溫度變化、流動相和組成變化的影響，噪聲和漂移大，靈敏度低，不能用梯度洗脫。2.專用檢測器用於測量被分離的樣品組分的某些特性的變化。
這種檢測器對樣品中組分的某種物理或化學性質敏感，而這種性質在流動相中是不具備的，或者至少在操作條件下不會表現出來。這種檢測器包括紫外線檢測器、熒光檢測器、放射性檢測器等。
高效液相色譜儀的工作原理是什麽？
高效液相色譜儀的工作原理；高壓泵將儲液罐的流動相通過進樣器送入色譜柱，然後從檢測器的出口流出。此時，整個系統充滿了流動相。當待分離的樣品從進樣器進入時，流經進樣器的流動相將其帶入色譜柱進行分離。分離後，不同組分依次進入檢測器，記錄儀記錄進入檢測器的信號，得到液相色譜圖。
高效液相色譜是指在經典色譜基礎上發展起來的氣相色譜理論。技術上，流動相改為高壓輸送，色譜柱以特殊方式填充小粒徑填料，使柱效遠高於經典液相色譜(每米塔板數可達數萬或數十萬)，柱後連接高靈敏檢測器，可連續檢測流出液。
擴展數據
高效液相色譜儀配有高壓二元泵或低壓四元泵，泵的沖程容積和混合器的容積都會對色譜基線噪音水平產生影響，尤其是在梯度洗脫時。壹般泵的沖程容積越小，混合器的容積越大，輸液引起的脈沖越小，對梯度變化的響應能力越高，基線越平滑。
使用二元泵時需要註意的是，當二元混合中壹種流動相的比例小於5%時，特別是使用正相洗脫進行某些藥物中間體和最終產品的手性拆分時，最好使用單泵預混法。避免在色譜基線上出現與沖程相關的峰，因為在低比率下泵的泵送精度相對較差。
參考來源；搜狗百科-高效液相色譜儀
高效液相色譜儀的基本工作原理
高效液相色譜儀的基本工作原理
高效液相色譜系統由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器和記錄器等幾部分組成。儲液器中的流動相由高壓泵泵入系統，樣品溶液通過進樣器進入流動相，由流動相加載到色譜柱(固定相)中。由於樣品溶液中各組分在兩相中的分配系數不同，當它們在兩相中相對移動時，經過反復的吸附-解吸分配過程，各組分的移動速度相差很大，被分離成單壹組分依次流出柱外。當通過檢測器時，樣品濃度被轉換成電信號進行傳輸。
高效液相色譜的原理是什麽？
原理:儲液器中的流動相由高壓泵打入系統，樣品溶液通過進樣器進入流動相，由流動相加載到色譜柱(固定相)中。由於樣品溶液中各組分在兩相中的分配系數不同，當它們在兩相中相對移動時，經過反復的吸附-解吸分配過程，各組分的移動速度相差很大。
分離出的組分依次從柱中流出，經過檢測器時，樣品濃度被轉換成電信號，傳輸到記錄儀，這樣就可以將數據以圖譜的形式打印出來，供研究人員分析。擴展數據:
高效液相色譜(HPLC)又稱為高壓液相色譜、高速液相色譜、高分辨率液相色譜和現代柱色譜。
①高壓:流動相是液體，流過色譜柱時受到很大阻力。為了快速通過色譜柱，必須對載液施加高壓。②速度快:分析速度快，載液流速快，比經典液相色譜快很多。通常分析壹個樣品需要15~30分鐘，有的樣品甚至可以在5分鐘內完成，壹般不到1小時。
③高效:分離效率高。可以選擇固定相和流動相，達到最佳的分離效果，比工業蒸餾塔和氣相色譜儀高出許多倍。
④高靈敏度:紫外檢測器可達0.01ng，樣品體積在μ l量級..⑤應用範圍廣:高效液相色譜可以分析70%以上的有機化合物，特別是沸點高、大分子、極性強、熱穩定性差的化合物的分離分析，顯示出優勢。
⑥色譜柱可重復使用:壹根色譜柱可分離不同的化合物。⑥樣品體積小，易於回收:樣品通過色譜柱後不被破壞，可收集或制備單壹組分。另外，高效液相色譜有很多優點，比如色譜柱可以重復使用，樣品不被破壞，容易回收等，但也有壹些缺點。與氣相色譜法相比，高效液相色譜法各有優勢，互為補充。
高效液相色譜的缺點是有“柱外效應”。在任何死空間(註射器、柱連接器、連接管和檢測池等。)從進樣到檢測器，如果流動相的流型發生變化，被分離物質的任何擴散和滯留都會顯著導致色譜峰變寬，柱效下降。
HPLC檢測器的靈敏度不如氣相色譜檢測器。HPLC所用的色譜柱很細(1~6 mm)，所用固定相的粒徑也很小(幾個微米到幾十個微米)，所以流動相在柱內的流動受到很大阻礙。在常壓下，流動相的流速很慢，柱效低且費時。
為了實現快速有效的分離，必須對流動相施加很大的壓力以加速其在柱中的流動。所以高壓輸液壹定要用高壓泵。
高壓、高速是高效液相色譜的特點之壹。HPLC使用的高壓泵應滿足以下條件:a .流量恒定，無脈動，調節範圍大(壹般為1 ~ 10mL/min)；b .能抗溶劑腐蝕；c .有較高的輸註壓力；壹般分離，60 * 10 5pa的壓力就夠了，高效分離，要求達到150 ~ 300 * 10 5pa。
(1)往復式活塞泵當柱塞推入缸內時，泵頭出口(上部)的單向閥打開，同時流動相進入的單向閥(下部)關閉，因此輸出少量流體。相反，當向外拉柱塞時，流動相入口處的單向閥打開，同時出口處的單向閥關閉，壹定量的流動相被其貯液器吸入圓筒。
這種泵的特點是不受整個色譜系統其余部分的阻力的微小變化的影響，它連續地提供恒定體積的流動相。⑵氣動放大泵的工作原理是壓力為p1的低壓氣體推動大面積(SA)活塞A，然後小面積(SB)活塞B輸出壓力增加到p2的液體。
壓力增加的倍數取決於兩個活塞A和B的面積比，如果A和B的面積比為50: 1，壓力為5 * Pa的氣體可以得到壓力為250*Pa的輸出液體。這是壹個恒壓泵。
參考資料:
百度百科-高效液相色譜。
HPLC儀器的工作原理是什麽？
高效液相色譜是在經典色譜的基礎上引入氣相色譜的理論。技術上流動相改為高壓輸送(最大輸送壓力可達4.9？107 pa)；色譜柱以特殊方式填充小粒徑填料，使柱效遠高於經典液相色譜(每米塔板數可達數萬或數十萬)；同時在柱後連接壹個高靈敏度的檢測器，可以連續檢測流出液。
特色1。高壓:液相色譜以液體為流動相(稱為載液)，液體流經色譜柱，受到的阻力很大。為了快速通過色譜柱，必須對載液施加高壓。壹般可以達到150~350*105Pa。
2.高速:柱內流動相流速比經典色譜快得多，壹般可達1~10ml/min。高效液相色譜所需的分析時間比經典液相色譜少得多，壹般小於1h。
3.高效:最近開發了很多新的固定相，大大提高了分離效率。4.高靈敏度:高靈敏度檢測器已廣泛應用於高效液相色譜，進壹步提高了分析的靈敏度。
比如熒光檢測器的靈敏度可以達到10-11g。此外，樣品量少，通常為幾微升。
5.適用範圍廣:氣相色譜與高效液相色譜的比較:氣相色譜雖然具有分離能力好、靈敏度高、分析速度快、操作方便等優點，但由於技術條件限制，很難用氣相色譜分析沸點過高或熱穩定性差的物質。而高效液相色譜只要求樣品無需氣化即可制成溶液，所以不受樣品揮發性的限制。
原則上可以用高效液相色譜法分離分析沸點高、熱穩定性差、相對分子量大(400以上)的有機物(這些物質幾乎占有機物總量的75% ~ 80%)。據統計，在已知的化合物中，大約20%可以用氣相色譜分析，70~80%可以用液相色譜分析。
根據其固定相的性質，高效液相色譜可分為高效凝膠色譜、疏水高效液相色譜、反相高效液相色譜、高效離子交換液相色譜、高效親和液相色譜和高效聚焦液相色譜。不同類型的高效液相色譜分離或分析各種化合物的原理與相應的普通液相色譜基本相似。
不同的是，HPLC靈敏、快速、分辨率高、重復性好，而且必須在色譜儀中進行。高效液相色譜的主要類型及分離原理根據分離機理的不同，高效液相色譜可分為以下主要類型:1。液-液分配色譜和化學鍵合相色譜。流動相和固定相都是液體。
流動相和固定相應互不相溶(極性不同，避免固定液流失)，並有明顯的界面。當樣品進入色譜柱時，溶質分布在兩相之間。
當達到平衡時，它服從下面的公式:在公式中，CS是固定相中溶質的濃度；cm——流動相中溶質的濃度；vs-固定相的體積；VM-流動相的體積。LLPC與GPC相似，即分離級數取決於K，K越大，組分的保留值越大。然而，也有不同之處。在廣義預測控制中，流量對K的影響很小，而LLPC流量對K的影響很大..
A.正相液相色譜:流動相的極性小於固定相。b .反相液相色譜:流動相極性大於固定相極性。
C.液-液分配色譜的缺點:雖然流動相和固定相的極性要求完全不同，但固定相仍有少量溶出；流動相通過色譜柱時的機械沖擊會造成固定液的損失。20世紀70年代末開發的化學鍵合固定相(見下文)可以克服上述缺點。
現在廣泛使用(70~80%)。2.液固色譜的流動相為液體，固定相為吸附劑(如矽膠、氧化鋁等。).
這種分離是根據物質吸附的不同而進行的。其機理是當樣品進入色譜柱時，溶質分子(X)和溶劑分子(S)競爭吸附吸附劑表面的活性中心(不進樣時，吸附劑的所有活性中心都吸附S)，可表示為:XM+NSA = = = = = XA+NSM: Xm -流動相中的溶質分子；Sa -固定相中的溶劑分子；Xa -固定相中的溶質分子；Sm -流動相中的溶劑分子。
當競爭吸附反應達到平衡時，K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]其中K為吸附平衡常數。【討論:k越大，保留值越大。
3.離子交換色譜)IEC使用離子交換劑作為固定相。IEC基於離子交換樹脂上的可電離離子和流動相中帶相同電荷的溶質離子之間的可逆交換，這些離子根據它們與交換劑的不同親和力而被分離。
以陰離子交換劑為例，交換過程可以表示為:X-(在溶劑中)+(樹脂-r4n+cl-) =(樹脂-R4N+ X-)+Cl-(在溶劑中)當交換達到平衡時:kx =[-R4N+X-][Cl-]/[-R4N+Cl-]。【Cl-】【討論:DX與保留值的關系】凡是能在溶劑中電離的物質，通常都可以用離子交換色譜分離。4.離子對色譜離子對色譜是在流動相或固定相中加入壹種(或多種)與溶質分子電荷相反的離子(稱為抗衡離子或反離子)，使其與溶質離子結合形成疏水離子對化合物，從而控制溶質離子的保留行為。
其原理可用下式表示:X+水相+Y-水相= = X+Y-有機相:X+水相-流動相中待分離的有機離子(或陽離子)；Y-水相-流動相中帶相反電荷的離子對(如四丁基氫氧化銨、十六烷基三甲基氫氧化銨等。);X+y型。
液相色譜儀的用途和工作原理
工作原理:流動相通過輸液泵流經進樣閥，與樣品溶液混合，流經色譜柱，在色譜柱中被吸附分離。最後，各組分通過檢測器轉化為電信號，相應的樣品峰出現在色譜工作站上。
液相色譜的使用:首先對樣品進行預處理，然後進樣，進樣後，清洗進樣口，每次分析後，清洗通道，最後關閉儀器。擴展數據:
液相色譜中使用的保留值、塔板數、塔板高度、分離度和選擇性等基本概念與氣相色譜中使用的基本概念壹致。
液相色譜使用的基礎理論:塔盤理論和速率方程與氣相色譜基本相同，但由於氣相色譜使用液體作為流動相，所以液體和氣體的性質不同。另外，液相色譜所用的儀器、設備和操作條件也與氣相色譜不同，所以液相色譜和氣相色譜有壹定的區別。
主要有以下幾個方面:①不同的操作條件和適用範圍。對於氣相色譜，它是加熱操作。它只能分析在操作溫度下能汽化而不分解的物質，難以分離分析高沸點化合物、不揮發物質、熱不穩定化合物、離子化合物和聚合物，在壹定程度上限制了它的應用。據統計，只有20%左右的有機物可以用氣相色譜法分析。
液相色譜在室溫下操作，不受樣品揮發性和熱穩定性的限制。非常適用於分離分析相對分子質量較大的物質、離子化合物、聚合物等難汽化、難揮發或對熱敏感的物質，約占有機物的70%~80%。(2)液相色譜可以完成困難的分離工作。a .氣相色譜的流動相載氣為色譜惰性，基本不參與分配平衡過程，與樣品分子無親和力，樣品分子主要與固定相相互作用。
在液相色譜中，流動相液體也與固定相競爭樣品分子，這增加了提高選擇性的因素。也可以選擇兩種或兩種以上不同比例的液體作為流動相，以提高分離的選擇性。
B.液相色譜中固定相的種類很多，如離子交換色譜、排阻色譜等，因此分析的選擇也很多。氣相色譜是不可能的。c .液相色譜通常在室溫下操作，較低的溫度壹般有利於色譜分離條件的選擇。
③由於液體的擴散系數比氣體小105倍，溶質在液相中的傳質速率較慢，柱外效應尤為重要；在氣相色譜中，由柱外面積引起的膨脹可以忽略。④液相色譜中，樣品制備簡單，樣品回收相對容易，回收定量，適合批量制備。然而，液相色譜仍然缺乏通用的檢測器，該檢測器復雜且昂貴。
在實際應用中，這兩種技術是相輔相成的。綜上所述，液相色譜具有柱效高、選擇性高、靈敏度高、分析速度快、重復性好、適用範圍廣等優點。這種方法已經成為現代分析技術的主要手段之壹。
目前已廣泛應用於化學、化工、醫學、生物化學、環保、農業等科學領域。高效液相色譜的應用非常廣泛，幾乎涵蓋了定量和定性分析的所有領域。
(1) HPLC只要求樣品可以制成溶液，不受樣品揮發性的限制。流動相可選擇範圍廣，固定相種類多，可分離熱不穩定和不揮發、解離和未解離、各種分子量範圍的物質。配合樣品預處理技術，高效液相色譜可以達到高分辨率和高靈敏度，可以同時分離和測定性質非常相似的物質，可以分離復雜混合物中的痕量組分。
隨著固定相的發展，生化物質的分離可以在充分保持其活性的條件下完成。(2)生化分析由於HPLC具有高分辨率、高靈敏度、高速度、色譜柱可重復使用、流出液組分易於收集等優點，已被廣泛應用於生物化學、食品分析、醫學研究、環境分析、無機分析等各個領域，成為解決生化分析問題最有前途的方法。
(3)儀器組合高效液相色譜與結構儀器的組合是壹個重要的發展方向。高效液相色譜-質譜(HPLC-MS)技術受到了高度重視，如氨基甲酸酯類農藥和多核芳香烴的分析。HPLC-IR光譜技術也發展迅速，如在環境汙染分析中對水中烴類的測定，使環境汙染分析有了新的發展參考。
百度百科-液相色譜。
液相色譜儀的原理是什麽？這是為了什麽？
液相色譜儀原理:儲液器中的流動相由高壓泵打入系統，樣品溶液通過進樣器進入流動相，由流動相加載到色譜柱(固定相)中。由於樣品溶液中各組分在兩相中的分配系數不同，當它們在兩相中相對移動時，經過反復的吸附-解吸分配過程，各組分的移動速度相差很大，被分離成單壹組分依次流出柱外。當通過探測器時，
主要用於通過色譜柱分離高沸點難氣相化合物的混合物。用於生物化學、生物醫學、環境化學、石油化工等部門。
擴展數據液相色譜儀根據固定相是液體還是固體，可分為液-液色譜(LLC)和液-固色譜(LSC)。現代液相色譜儀由高壓輸液泵、進樣系統、溫控系統、色譜柱、檢測器、信號記錄系統等組成。
與經典的液相柱色譜裝置相比，它具有高效、快速、靈敏的特點。高效液相色譜儀主要包括進樣系統、進樣系統、分離系統、檢測系統和數據處理系統。
註射系統壹般采用隔膜註射器或高壓註射室完成註射操作，註射量恒定。這有利於提高分析樣品的重復性。
輸註系統該系統包括三個部分:高壓泵、流動相儲罐和梯度儀。高壓泵壹般壓力為l.47~4.4X10Pa，流量可調且穩定。高壓流動相通過色譜柱時，可以降低樣品在柱內的擴散效應，加快其移動速度，有利於提高分辨率，回收樣品，保持樣品的生物活性。
分離系統該系統包括色譜柱、連接管和恒溫器。壹般色譜柱長度為10~50cm(兩柱並用時可在二者之間加連接管)，內徑為2~5mm，材質為優質不銹鋼、厚壁玻璃管或鈦合金，住所配固定相，粒徑為5~10μm(由基質和固定液組成)。