(1) Southern雜交:電泳分離DNA片段，從凝膠上轉移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，然後與探針雜交。檢測的對象是DNA，探針是DNA或RNA。
(2) Northern雜交:電泳後將RNA片段從凝膠上轉移到硝酸纖維素濾膜上，然後與探針雜交。檢測的對象是RNA，探針是DNA或RNA。
根據雜交使用的方法，還有點雜交、槽雜交和菌落原位雜交。三種固相支持物可用於雜交:硝酸纖維素濾膜、尼龍膜和Whatman 541濾紙。不同品牌的尼龍膜需要區別對待，DNA固定和雜交要嚴格按照廠家說明書進行。Whatman 541濾紙濕強度高，最早用於篩選細菌菌落。濾紙主要用於篩選壹些基因文庫。固定化DNA的雜交條件基本上與使用硝酸纖維素濾膜時建立的條件相同。Whatman 541濾紙與硝酸纖維素濾膜相比有壹些優勢:更便宜，雜交更耐用，幹燥過程中更不容易變形碎裂。然而，如果變性過程不小心，雜交信號的強度將明顯弱於使用硝酸纖維素濾膜獲得的信號。因此，硝酸纖維素濾膜仍被用作常規細菌篩選和各種雜交的固相支持物。Southern雜交可用於檢測限制性內切酶切割的DNA片段中是否存在與探針同源的序列，包括以下步驟:
(1)酶切DNA，凝膠電泳分離酶切片段，然後原位變性DNA。
(2)將DNA片段轉移到固體支持物(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上。
(3)預雜交濾膜以覆蓋濾膜上的非特異性位點。
(4)將探針與同源DNA片段雜交，然後沖洗除去非特異性結合的探針。
(5)通過顯影檢查靶DNA的位置。
Southern雜交能否檢測到雜交信號取決於許多因素，包括靶DNA在總DNA中的比例、探針的大小和比活性、轉移到濾膜上的DNA量以及探針與靶DNA之間的配對。在最佳條件下，經過幾天的放射自顯影曝光後，Southern雜交可以靈敏地檢測到活性小於0.1pg的高活性探針和32 P標記(>:109 cpm/μg)互補DNA的比活性。如果將10μg基因組DNA轉移到濾膜上，與長度為幾百個核苷酸的探針雜交，暴露過夜，可以在哺乳動物基因組中檢測到大小為1kb的單拷貝序列。
DNA從凝膠轉移到固相支持物上主要有三種方法:(1)毛細管轉移。這種方法是南方人發明的，所以也叫南方轉移(或印跡)。毛細管轉移法的優點是簡單，不需要其他儀器。缺點是轉移時間長，轉移後雜交信號弱。(2)電泳轉移。DNA變性後，可以通過電泳轉移到帶電的尼龍膜上。這種方法的優點是不需要脫嘌呤/水解，可以直接轉移較大的DNA片段。缺點是轉移中電流大，溫度難以控制。電泳轉移通常僅在毛細管轉移和真空轉移無效時使用。(3)真空轉移。有許多商業真空轉移儀器。壹般他們把硝酸纖維素膜或尼龍膜放在真空室上方的多孔網上，然後把凝膠放在濾膜上，緩沖液從上方的儲液槽流下來，洗脫凝膠中的DNA，沈積在濾膜上。這種方法的優點是快速，它可以從正常厚度(4-5mm)和正常瓊脂糖濃度(
1，材料:待測DNA，標記探針。
2.設備:電泳儀、電泳槽、塑料盆、真空爐、放射自顯影盒、x光片、雜交袋、硝酸纖維素膜或尼龍膜、濾紙。
3.試劑:
(1)10毫克/毫升溴化乙錠(EB)。
(2)50×Denhardt溶液:5克Ficoll-40，5克PVP，5克BSA加水至500毫升，過濾滅菌，保存於-20℃。
(3)1×布洛托:脫脂奶粉5g，0.02%疊氮化鈉，4℃保存。
(4)預雜交液:6× SSC，5× Denhardt，0.5% SDS，100 mg/ml鮭魚精DNA，50%甲酰胺。
(5)雜交液:在預雜交液中加入變性探針即為雜交液。
(6)0.2摩爾/升鹽酸.
(7)0.1%十二烷基硫酸鈉.
(8)0.4摩爾/升氫氧化鈉.
(9)變性溶液:將87.75克氯化鈉、20.0克氫氧化鈉加水至1000毫升。
(10)中和溶液:175.5g NaCl，6.7g Tris Cl Cl，加水至1000ml。
(11)硝酸纖維素濾膜。
(12) 20× SSC: 3 mol/L NaCl，0.3 mol/L檸檬酸鈉，用1mol/L HCl調節pH至7.0；
(13)2×、1×、0.5×、0.25×和0.1×SSC:用20×SSC稀釋。
4、操作步驟:
(1)將10pg-10μg的DNA以約50μl的體積消化，然後在瓊脂糖凝膠中電泳12-24小時(包括DNA分子量標準)。
(2)將25μl 10mg/ml溴化乙錠加入500 ml水中，將凝膠放入其中染色30分鐘，然後拍照。
(3)依次用下列溶液處理凝膠，輕輕搖勻:500ml 500ml 0.2mol/L HCl 10+00分鐘，倒掉溶液(若限制性片段>:10kb，酸處理時間為20分鐘)，水洗數次，倒掉溶液；500ml變性溶液兩次，每次15分鐘，將溶液倒掉；500毫升中和溶液30分鐘。如果用尼龍膜雜交，這壹步可以省略。
(4)戴上手套，向皿中加入20×SSC溶液，先用無菌水將硝酸纖維素濾膜完全浸濕，再用20×SSC浸濕。將硝酸纖維素濾膜壹次準確覆蓋在凝膠上，去除氣泡。用浸泡在20×SSC溶液中的3張濾紙覆蓋濾膜，然後加入幹燥的3張濾紙和幹紙巾，根據DNA的復雜程度，轉移2-12小時。使用尼龍膜雜交時，可將膜在水中浸泡壹次，轉移時用0.4mol/L NaOH代替20×SSC。簡單的印跡轉移需要2-3個小時，對於基因組印跡，通常需要很長時間才能轉移。
(5)取下紙巾，用藍色圓珠筆在濾膜右上角寫下轉移日期，做好標記，取出濾膜，在2×SSC中清洗5分鐘，晾幹後80℃烘烤2小時。註意，用尼龍膜雜交時，只能風幹，不能烘烤。
(6)將濾膜放入裝有6-10ml預雜交液的密封小塑料袋中，將預雜交液加入袋底，來回擠壓袋子，使濾膜濕潤。在壹定溫度下(壹般為37-42℃)預雜交3-65438±02小時，棄去預雜交液。
(7)準備同位素標記探針(見第1節)，並將探針煮沸5分鐘。
(8)將探針加入雜交液中，混合均勻。如步驟(6)中所述，將混合溶液註入密封的塑料袋中，並在與預雜交相同的溫度下雜交6-65438±02小時。
(9)取出濾膜，依次用下列溶液處理，輕輕搖勻:室溫下，1× SSC/0.1% SDS，15分鐘，兩次。在雜交溫度下，0.25× SSC/0.1% SDS，15分鐘，兩次。
(10)風幹硝酸纖維素濾膜，然後在x光片上曝光。DNA條帶通常在暴露於1-2天後可見。對於從gap翻譯過來的≥108 cpm/μg的探針，從10μg哺乳動物DNA中很容易檢測到10pg的單拷貝基因。北方雜交和南方雜交非常相似。主要區別在於檢測的對象是RNA，其電泳是在變性條件下進行，去除RNA中的二級結構，保證RNA按照分子大小完全分離。變性電泳有三種:乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳和羥甲基汞變性電泳。電泳後，RNA以與Southern轉移相同的方式通過瓊脂糖凝膠轉移到硝酸纖維素膜上，然後與探針雜交。
1.材料:待測RNA和制備的探針。
2.設備:電泳儀、電泳槽、塑料盆、真空爐、放射自顯影盒、x光片、雜交袋、硝酸纖維素膜或尼龍膜。
3.試劑:
(1)20×SSPE:175.3g NaCl，88.2 g檸檬酸鈉，溶於800ml水中，用10mol/LNaOH調節pH值至7.4，最後溶解至1L。
(2)其他試劑:類似於Southern雜交試劑，除了所有試劑都用DEPC處理。
4、操作步驟:
(1)RNA經變性和電泳後，乙醛酰基RNA可立即轉移到硝酸纖維素濾膜上。轉移方法類似於轉移DNA的方法。
(2)轉移後，在室溫下將膜浸泡在6×SSC溶液中5分鐘，以去除瓊脂糖片段。
(3)將雜化膜夾在兩張濾紙之間，在80℃的真空烘箱中幹燥0.5-2小時。
(4)與以下兩種溶液之壹預雜交1-2小時。如果在42℃，50%甲酰胺，5×SSPE，2×登哈特氏試劑，0.1% SDS條件下進行；應該使用；如果在68℃下進行，應使用6×SSC、2×Denhardt氏試劑和0.1% SDS(註:BLOTTO不能用於Northern雜交)。
(5)向預雜交溶液中加入變性的放射性標記的探針。如果要檢測低豐度mRNA，所用探針的量至少應為0.1μg，其比活性應大於2×108 cpm/ min μ g，並將其置於合適的溫度條件下雜交16-24小時。
(6)室溫下用1×SSC和0.1% SDS洗膜20分鐘，然後在68℃下用0.2×SSC和0.1% SDS洗膜三次，每次20分鐘。
(7)用x光膠片(柯達XAR-2或同等產品)進行放射自顯影，並在附加增感屏的情況下在-70℃下曝光24-48小時。
[註意]
(1)如果瓊脂糖濃度高於1%，或者凝膠厚度大於0.5cm，或者待分析的RNA大於2.5kb，則需要用0.05mol/LNaOH浸泡凝膠20分鐘，使RNA部分水解，提高轉移效率。浸泡後，用DEPC處理的水洗滌凝膠，並用20×SSC浸泡45分鐘。然後轉移到濾膜上。
(2)在步驟(3)的操作中，如果濾膜含有乙醛酰基RNA，雜交前要用20 mmol/L tris Cl (pH 8.0)在65℃下沖洗濾膜，以去除RNA上的乙二醛分子。
(3)將RNA從凝膠轉移到尼龍膜上的方法與將RNA轉移到硝酸纖維素濾膜上的方法相似。
(4)在RNA轉移之前，含有甲醛的凝膠需要用DEPC處理的水洗滌幾次以除去甲醛。使用尼龍膜進行雜交時，要註意壹些帶正電荷的尼龍膜在堿性溶液中具有固定核酸的能力，要用7.5mmol/LNaOH溶液洗脫瓊脂糖中的乙醛酰基RNA，同時可以部分水解RNA，增加RNA分子長度(>:2.3kb)的轉移速度和效率。此外，堿可以去除mRNA分子的乙二醛加合物，省去了固定後洗脫的步驟。在堿性條件下將乙醛酰基RNA轉移到帶正電荷的尼龍膜上的操作也是通過DNA轉移進行的，但轉移緩沖液是7.5mmol/LNaOH。轉移後(4.5-6.0小時)，尼龍膜需要用2×SSC和0.1%SDS漂洗壹段時間，室溫下晾幹。
(5)尼龍膜的缺點是背景高，尤其是使用RNA探針時。將濾膜長時間置於高濃度堿性溶液中會導致雜交背景明顯升高，可通過增加預雜交和雜交步驟中封閉劑的用量來解決。
(6)如果使用中性緩沖液進行RNA轉移，轉移後，將幹燥的尼龍膜夾在兩張濾紙之間，在80℃下幹燥0.5-2小時，或者用波長為254nm的紫外線照射尼龍膜的含RNA面。後壹種方法更復雜，但它是優選的，因為某些批次的帶正電荷的尼龍膜的雜交信號在這種處理後可以增強。但為了獲得最佳效果，需要保證尼龍膜不過度曝光。適度照射可促使RNA上的少量堿基與尼龍膜表面帶正電荷的氨基形成交聯結構，而過度照射則使RNA上的壹部分胸腺嘧啶與尼龍膜表面結合，導致雜交信號減弱。該方法可用於克隆和篩選分散在幾個瓊脂平板上的少數菌落(100-200)。將這些菌落合並到主瓊脂平板中，並將硝酸纖維素濾膜置於第二個瓊脂平板的表面上。培養壹段時間後，菌落被原位裂解。主板應儲存在4℃下，直到獲得篩選結果。
1.材料:待測細菌平板、標記探針、硝酸纖維素濾膜等。
2.設備:恒溫烘箱、恒溫水浴、臺式高速離心機等。
3.試劑:
(1)磅固體培養基。
(2)0.5摩爾/升氫氧化鈉.
(3)1摩爾/升Tris Cl .
(4)1.5摩爾/升氯化鈉.
(5)0.5摩爾/升Tris Cl .
(6)預洗液:5× SSC，0.5% SDS，1 mmol/L EDTA (pH 8.0)。
(7)預雜交溶液:50%甲酰胺，6×SSC(或6×SSPE)，0.05×BLOTTO(不需要甲酰胺)。
(8)其他試劑:同Southern雜交。
4、操作步驟:
1.將壹些菌落轉移到硝酸纖維素濾膜上:
(1)將硝酸纖維素濾膜放在含有選擇性抗生素的瓊脂平板上。
(2)用無菌牙簽將每個菌落轉移到濾膜上，然後轉移到含選擇性抗生素但無濾膜的瓊脂主板上。線狀接種(或點狀接種)要按照壹定的網格進行。每個菌落應標記在兩個平板的相同位置。最後，在濾膜和主板上同時畫出含有非重組質粒(如pBR322)的菌落。
(3)將平板倒置，在37℃下培養，直到有標記的菌落長到寬度為0.5-65438±0.0毫米..
(4)用帶有防水黑色繪圖墨水的註射器針頭穿透濾膜，直至到達瓊脂，並在三個以上不對稱位置進行標記。在大致相同的位置標記主板。
(5)用石蠟膜密封主板，在4℃下倒置保存，直到獲得雜交反應結果。
(6)溶解細菌，並根據本段以下描述的方法將釋放的DNA與硝酸纖維素濾膜結合。
2.菌落裂解和DNA與硝酸纖維素濾膜的結合
(1)在壹張保鮮膜上做壹個裝滿0.5mol/L NaOH的小凹陷(0.75ml)，使菌落朝上，將濾膜放在凹陷處，壓平保鮮膜，使濾膜均勻濕潤，將濾膜放在原處2-3分鐘。
(2)用幹紙巾從濾膜下部吸幹濾膜，用新的保鮮膜和新配的0.5mol/L NaOH重復步驟(1)。
(3)吸幹濾膜，並將其轉移至新的含1 mol/L tris Cl (pH 7.4)的塑料膜凹陷處。5分鐘後，吸幹濾膜，再次重復此步驟。
(4)吸幹濾膜，轉移到含有1.5mol/L NaCl和0.5 mol/L Tris Cl (pH 7.4)的保鮮膜上5分鐘，然後吸幹濾膜，轉移到壹張錢濾紙上，室溫放置20-30分鐘，使濾膜幹燥。
(5)將濾膜夾在兩張幹燥濾紙之間，在80℃的真空烘箱中幹燥2小時以固定DNA。
(6)將固定在膜上的DNA與32 p標記的探針雜交
交叉
(1)用壹個裝有2×SSC的塑料托盤，將烘幹的濾膜漂浮在液面上，並充分浸泡5分鐘。
(2)將濾膜轉移到裝有200毫升預洗液的玻璃皿中。濾膜疊在壹起，放入溶液中。用保鮮膜蓋住玻璃皿，放在培養箱內的旋轉平臺上。在50℃下處理30分鐘。在此步驟和所有後續步驟中，應緩慢搖動濾膜，以防止它們粘在壹起。
(3)用浸過預洗液的脫脂棉紙輕輕擦去膜表面的細菌碎片，以降低雜交背景，而不影響陽性雜交信號的強度和清晰度。
(4)將濾膜轉移到含有150ml預雜交液的玻璃上，在合適的溫度下預雜交1-2h(即水溶液雜交68℃，50%甲酰胺雜交42℃)。
(5)將32 P標記的雙鏈DNA探針在100℃加熱5分鐘，迅速放入冰浴中。單鏈探針不必變性。將探針加入雜交袋中，雜交過夜。雜交時，裝有濾膜的容器應蓋緊，以防液體蒸發。
(6)雜交後，移去雜交液，立即將濾膜放入室溫下2×SSC和0.1% SDS的大體積(300-500ml)溶液中，輕輕搖動5min，至少翻轉濾膜壹次。重復清洗壹次，同時避免膜變幹。
(7)用300-500毫升1× SSC和0.1% SDS溶液在68℃下清洗膜兩次，每次1-1.5h..此時可以進行放射自顯影。如果背景很高或實驗要求嚴格，可用300-500 ml的0.2× SSC和0.1% SDS溶液在68℃浸泡濾膜60分鐘。
(8)將濾膜放在紙巾上室溫晾幹，然後將濾膜(編號向上)放在壹張保鮮膜上，在保鮮膜上做幾個不對稱的標記，使濾膜與放射性放射自顯影膠片的位置相對應。
(9)用第二層塑料薄膜覆蓋濾膜。用X線膠片和增感屏在-70℃下曝光12-16小時。
(10)底片顯影後，在底片上貼壹張透明紙板。在紙上標出雜交陽性信號的位置，同時標出不對稱分布點的位置。可以將透明紙從陰性中取出，陽性菌落可以通過將紙上的點與瓊脂上的點進行比較來鑒定。點雜交是將DNA或RNA樣品直接點在硝酸纖維素濾膜上，然後與核酸探針分子雜交，以顯示樣品中是否存在特定的DNA或RNA。通過在不同時間稀釋相同的樣品可以獲得半定量結果。因此，分析DNA或RNA是壹種簡單、快速、經濟的方法，常用於基因分析和基因診斷，是研究基因表達的有力工具。但是，因為靶序列沒有與非靶序列分開，所以不能知道靶序列的長度。特別是當背景幹擾較大時，很難區分目標序列信號和幹擾信號。
1.材料:待分析的DNA或RNA樣品，標記探針。
2.設備:槽式采樣器、真空泵、恒溫水浴、真空爐等。
3.試劑:
(1)100%甲酰胺。
(2)甲醛(37%)。
(3) 20×SSC .
(4)0.1摩爾/升氫氧化鈉.
(5)硝酸纖維素濾膜。
(6)濾紙。
4、操作步驟:
(1) 10μl樣品與20μl 100%甲酰胺、7μl 37%甲醛和2μl 20×SSC混合。混合後放入68℃的冰浴中15分鐘。
(2)用0.1mol/L NaOH清洗取樣器，然後用無菌水充分沖洗。在取樣器上鋪壹張20×SSC浸泡過的濾紙，再鋪壹張20×SSC浸泡過的硝酸纖維素濾膜1小時，蓋好夾好，打開真空泵。
(3)用10×SSC清洗每個孔。向每個樣品中加入兩倍體積的2×SSC，混合後將樣品加入孔中。將2μl染料加入幾個外圍孔定位，慢慢吸。用1毫升10×SSC清潔每個孔兩次。繼續抽吸5分鐘，吸幹濾膜。
(4)取出濾膜，夾在兩張濾紙中間，在80℃真空幹燥2小時。如上文Southern或Norhtern雜交中所述，與放射性標記的探針雜交。
[註意]
1.放射自顯影時，要註意濾膜壹定要幹燥，並用保鮮膜覆蓋，否則濾膜會粘在x光片上，給以後的操作帶來困難。
2、在雜交過程中，整個濾膜應始終保持濕潤，不能幹燥。
第三節雜交反應條件和參數的優化
不同反應條件對雜交結果的影響如下:
(1)根據雜交液的體積確定雜交時間:壹般來說，使用較小體積的雜交液比較好，因為在小體積的溶液中，核酸配對的速度較快，探針的用量較少，這樣濾膜上的DNA在反應中起主要作用。但在雜交過程中需要保證有足夠的雜交液覆蓋雜交膜。
(2)根據使用的雜交液確定雜交溫度:壹般來說，雜交相為水溶液時，68℃雜交，在50%甲酰胺溶液中時，42℃雜交。
(3)選擇不同的封閉試劑，如登哈特試劑、肝素或由5%脫脂奶粉組成的BLOTTO。這些試劑需要加入破碎的鮭魚精子DNA或酵母DNA，與SDS壹起使用。與Denhardt的試劑相比，BLOTTO便宜易用，也能獲得滿意的結果，但不能用於RNA雜交。壹般來說，尼龍膜用Denhardt氏試劑比用BLOTTO能得到更高的信噪比。對於硝酸纖維素濾膜，封閉劑通常包含在預雜交溶液和雜交溶液中。但對於尼龍膜，雜交液中往往省略封閉劑，因為高濃度的蛋白質會幹擾探針和靶基因的退火。
(4)雜交過程中根據需要選擇不同的振蕩方法和程度。當許多雜化膜壹起反應時，連續的輕微振蕩可以獲得更好的雜化結果。
(5)在雜交過程中加入其他化合物，如在反應體系中加入10%硫酸葡聚糖或10% PEG，雜交速度可提高約10倍。這種方法通常用於檢測稀有序列，但由於溶液的粘度，它們有時會導致高背景和難以操作。因此，除非濾膜中含有的靶DNA的量很少或放射性探針的量有限，否則壹般不使用硫酸葡聚糖或PEG。
(6)根據探針和檢測目標之間的同源性選擇清潔程度。如果有高度同源性，可以選擇緊密洗脫模式(高濃度SSC)，否則可以選擇非緊密洗脫模式(低濃度SSC)。洗脫通常在低於雜交體12-20℃的解鏈溫度下進行。解鏈溫度(Tm)是指當雙鏈DNA或RNA分子變性形成單獨的單鏈時，吸光度增加的中點溫度。通常，富含G C堿基對的序列的Tm溫度高於富含at堿基對的序列。Tm的計算方法請參考第8章。
(7)根據標記探針的濃度和比活性，選擇不同的雜交條件和檢測方法。壹般來說，使用新的同位素可以獲得強信號。
(8)在水溶液中雜交時，6×SSC和6×SSPE溶液的效果相同。但在甲酰胺溶液中雜交時，應使用緩沖能力更強的6×SSPE。
這些條件的變化對雜交結果有不同的影響，應根據研究的具體條件選擇合適的方法。