嘧啶核苷酸的從頭合成與嘌呤核苷酸不同，嘧啶環的元素來源於谷氨酰胺、二氧化碳和天冬氨酸，其特點是首先將這些原料合成嘧啶環，然後與PRPP反應生成。
①
嘧啶環的合成：谷氨酰胺、二氧化碳在胞液中由ATP供能，氨基甲酰合成酶Ⅱ催化下，生成氨基甲酰磷酸。後者又在天冬氨酸轉氨甲酰酶催化下，將氨基甲酰基轉移到天冬氨酸的氨基上生成氨甲酰天冬氨酸。氨甲酰天冬氨酸脫水環化，生成二氫乳清酸，再脫氫即成乳清酸（嘧啶衍生物）。
②
尿嘧啶核苷酸（UMP）和胞嘧啶核苷酸（cMP）合成：乳清酸與PRPP作用生成乳清酸核苷酸，後者脫羧即成尿苷酸。
尿苷酸是所有其他嘧啶核苷酸的前體。由尿嘧啶核苷酸轉變成胞嘧啶核苷酸是在核苷三磷酸水平上進行的。UMP經相應的激酶催化而生成UDP和UTP，由谷氨酰胺提供氨基，使UTP轉變為CTP。