直接測序是基於MSP進壹步研究CpG島甲基化的方法。亞硫酸鹽使DNA中未甲基化的胞嘧啶脫酰胺化，變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。PCR擴增後(引物設計中盡可能避免CpG，以免受甲基化因素影響)，尿嘧啶全部轉化為胸腺嘧啶。最後，對PCR產物進行測序。與未處理的序列相比，可以判斷CpG位點是否甲基化。該方法是壹種高度可靠和準確的方法，可以明確目的片段中每個CpG位點的甲基化狀態。在尋找有意義的關鍵CpG站點方面有著無可比擬的優勢。測序法以CpG島兩側無CpG點的壹段序列為引物配對區。因此，甲基化和未甲基化的靶序列可以同時擴增。它的缺點是費時費錢。為了獲得可靠的數據，至少需要對10個克隆進行測序。需要大量克隆和質粒提取測序，過程繁瑣且昂貴。
第壹部分是基因組DNA的提取。
這壹步毫無懸念。妳可以買壹套細胞或組織的DNA提取工具。如果實驗室條件成熟，可以自己提取。DNA相對穩定。只要手術中不使用暴力，提出的基因組DNA應該是完整的。
這壹步重點在於DNA的純度，即減少或避免RNA和蛋白質的汙染非常重要，所以在提取過程中要使用蛋白酶K和RNase來去除。
使用兩者的詳細信息:
1:蛋白酶K可用滅菌雙蒸水配制成20mg/ml；
2.RNase必須配制成不含DNase的RNase，即市面上購買RNase後，配制成10mg/ml。否則可能的後果是不僅沒有2:RNA，DNA也被消化。兩者都保存在-20℃下。
有兩種方法可以驗證提取的DNA的純度:
1:紫外分光光度計計算OD比值；
2: 1%-1.5%瓊脂糖凝膠電泳。
我更喜歡第二種方法，它可以完全明確提出的基因組DNA的純度，並根據標記的樣本大小估計其濃度，以便進行下壹次修改。
第二部分是亞硫酸氫鈉對基因組DNA的修飾
除非另有說明，所有的DDW都用高壓蒸汽滅菌。
1:將約2微克DNA稀釋至50微升；在1.5mlEP管中加入DDW；
2:加入5.5ul新制備的3M NaOH；
3: 42℃水浴30分鐘；；
水浴期間的準備工作:
4: 10 mm氫醌，水浴後向混合溶液中加入30ul(溶液變成淡黃色)
5: 3.6m亞硫酸氫鈉(適馬，S9000)，配制方法:1.88g亞硫酸氫鈉用DDW稀釋，用3M NaOH滴定至PH 5.0，定容至5ml。這麽大濃度的亞硫酸氫鈉很難溶解，但是加入NaOH後會慢慢溶解，需要耐心。PH值必須正好為5.0。水浴後向上述溶液中加入520微升。
6: EP管用鋁箔紙包裹，避光，溶液輕輕倒置。
7:加入200 ul石蠟油，防止水分蒸發，限制氧化。
8: 50℃黑水浴16h。
壹般這壹步從下午4點開始，熟練的話不到5點就能完成。16h的水浴是第二天早上8點剛過，非常適合。
此步驟的詳細信息:
1:基因組DNA的量不需要非常精確，寧可多也不要少，因為在後續的純化和回收步驟中會損失掉，這種方法最多可以修改到4ug。
2.所有試劑必須是新鮮配制的，所以配液的技術必須過關，既要快又要準。
3.亞硫酸氫鈉溶液呈強酸性，必須用堿調節PH值至5.0，否則PH值不當會影響後續的凈化和吸收。
4.最好的水浴是16小時，雖然可以短到8小時，但是後面的修改會不徹底。
第三部分是修飾DNA的純化和回收
除非另有規定，否則EP管采用高壓滅菌。
1.將移液槍頭置於石蠟油層下，先輕輕加壓排出壹小截石蠟油，再將混合液吸入幹凈的1.5mlEP管中。
2.下面使用Promega向導清理DNA純化和回收系統(Promega，A7280)。
1)70℃水浴預熱DDW；；制備80%異丙醇；
2)加入1ml Promega的Wizard DNA清理樹脂，輕輕倒置混合均勻，使DNA與樹脂充分結合；
3)由於試劑盒只配有註射器，沒有針塞，如果有真空負壓吸引器，使用起來非常方便；如果沒有，需要自備3ml-5ml註射器。註射器筒與試劑盒提供的回收柱緊密連接後，用移液管將上述混合物移入註射器內，柱下放置2ml以上的EP管接收廢液。加入針塞，輕輕按壓，擠出液體。此時，在柱中可以看到白色樹脂沈積物。
4)將註射器與藥筒分離後，拔出插銷，然後將註射器與藥筒連接，在註射器中加入2ml 80%的異丙醇，插入插銷，輕輕按壓，擠出異丙醇。這是洗滌步驟。
5)將註射器與藥筒分離，將藥筒放在1.5ml的幹凈EP管上，以12000 rpm離心2分鐘，以除去殘留的異丙醇並幹燥樹脂。此時，修飾的DNA處於與樹脂結合的狀態。
6)取出色譜柱並將其放在另壹個幹凈的1.5mlEP管上，向移液管中加入50微升預熱的DDW，並在室溫下放置5分鐘。
7)離心12000轉20s，這是洗脫步驟。此時，EP管中的液體是最終體積為50ul的洗脫的修飾DNA溶液。
3:加入5.5微升新制備的3M NaOH，並在室溫下放置65438±05分鐘。
4:添加33ul 10M乙酸銨以中和NaOH，並使溶液的PH值約為7.0。
5.加入4U10 mg/ml糖原作為沈澱指示劑，因為它與乙醇混合後能產生沈澱，便於離心後識別回收物的位置，防止回收物在吸收殘留乙醇時被吸走。其實很難說這些糖原能起到多大的作用。不過有國產糖原賣，包裝不大，很便宜。買的話要嚴格按照文獻上的步驟來。
6:加入270ul冰無水乙醇，置於-20℃下，靜置過夜。有人認為最短的沈降時間可以是2個小時，但我認為可能需要更長的時間。而做這壹步的時候，壹般會持續到中午。如果樣品很多，可能放壹夜比較好，所以時間安排可以放寬，順便做壹些其他的實驗。如果妳想當天完成，沒有問題，但是我覺得最好是長時間結算，至少6個小時。
7: 4，12000rpm離心30分鐘，倒出上清液，收集沈澱。沒必要完全吸收。
8:加入500ul 70% 70%乙醇，不要把沈澱物吹起來，只需加入乙醇即可。輕輕傾斜EP管，旋轉壹次，再次以4度12000 rpm離心5分鐘。離心後，倒掉上清液，加入等量的乙醇，再做壹次。這是壹個洗的步驟，* * *兩次。
9:倒掉上清液，室溫下短暫離心後，將貼壁的乙醇分離至EP管底部，用移液管小心吸取殘液，室溫下幹燥5分鐘，或當沈澱由不透明變為半透明或透明時，加入20ul- 30ulDDW溶解沈澱。到目前為止，修飾DNA的純化和回收已經完成，修飾DNA溶液可以用於進壹步的實驗。
10:-20℃保存DNA溶液。
此步驟的詳細信息:
1:使用註射器時，用力必須均勻、輕。如果使用暴力，柱中的膜將被壓碎並失去作用。
2.乙酸銨和糖原不需要新鮮制備。原糖配好後要在-20℃下保存，醋酸銨可以在室溫下保存，因為這樣濃度的醋酸銨非常不溶。壹旦放在4℃，取出時會有很多溶質析出。
3:異丙醇和70%乙醇不需要新鮮配制，但如果用量大，現場配制方便。
這壹步的關鍵是樹脂和DNA的結合，再次強調了第二部分調整亞硫酸鈉PH值的重要性。因為樹脂和DNA的結合需要壹個合適的PH值，如果前壹步沒有做好，這壹步樹脂就不能很好的和DNA結合，會帶來災難性的後果，就是DNA和液體壹起被擠出來，洗脫的時候其實是沒有DNA的。
修飾的DNA的第四部分用於PCR。
這壹步毫無懸念。我在這裏主要講幾個棘手的問題:
1:引物問題:感覺自己設計引物挺難的。我設計過幾對引物，嘗試過，但都以失敗告終。如果時間足夠，相對新的基因文獻不多，我自己設計引物是沒問題的。如果沒有，不如參考文獻。先查閱SCI分數高的文獻，再查閱著名實驗室的文獻。國內有就更好了。可以直接聯系咨詢。找到序列後，壹定要與Genbank中的序列進行比對，防止因排印錯誤造成的個別堿基差異。然後妳可以在谷歌上搜壹下，看用戶多不多，系統條件壹樣不壹樣。用戶多，系統條件相同，說明重復性比較強。我也是據此行事，比較順利。
2.Taq酶問題:有文獻使用高保真金牌Taq(白金)，但我感覺只要體系正確，變性退火等條件合適，壹般的熱啟動酶還是可以的。我開始用Takara的LA Taq，很好用，配有10x LA緩沖液，含mg++。有時候用完了，可以臨時用Takara的普通Taq酶。如何選擇？
3.PCR條件:變性壹般是95度，3m 3分鐘。我感覺剩下的都是根據文獻，退火可以根據妳的引物退火溫度小範圍嘗試。壹般和文獻報道差別不大。這只是擴增片段特異性的問題。建議遵循文獻。
4.PCR最好選擇進口EP管，管壁薄，厚度均勻，能保證溫度的快速變化能及時傳遞到管內的反應液，使系統真正在設定的溫度下運行。
5.PCR儀:如果是在某個儀器上做的，最好壹直用這個儀器。不同的儀器有不同的火候，但是EP管壹定要和儀器裏的插孔緊密結合，留有空隙，我覺得會影響溫度傳遞。
這部分有點啰嗦，只是壹些不成熟的個人經驗。有問題請指出來交流。我今天先來了，現在在寫壹些內容，比較費力，不能壹蹴而就。請原諒我。我休息壹下，準備寫藍白點篩選克隆的最後壹部分。
第五部分是PCR產物的凝膠回收。
這壹步相對簡單。可以買凝膠PCR產物回收試劑盒，國產的，價格合理，比如天根的產品(二手)。請按照說明操作。
壹些細節:
1:新配制的電泳液應用於PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳。凝膠濃度可以是1%-2%。
2.回收凝膠DNA時，在300nm紫外燈下觀察條帶位置，將目的片段所在的凝膠切開，盡可能小，保證特異性。
3.紫外線照射時間不宜過長，否則會損傷DNA。
4.回收的DNA如果不馬上使用，會保存在-20℃下，幾個月內非常穩定。
第六部分是PCR產物與T載體的連接轉化和藍白色斑點的篩選。
1:連接T載體(本實驗使用Promega的試劑盒)
15ul系統
T-easy 1ul
連接酶1ul
2x緩沖器7.5ul
DNA 5.5ul微升
4度，壹夜之間。
2.連接產物的轉化
1)-70度從冰箱中取出感受態細菌，融化後放在冰上；
2)連接產品15ul全部加入，冰30分鐘；
3)42度90秒；
4)冰上2分鐘；
5)800ul LB培養基；
6)280rpm，37度，搖床45分鐘(將試管瀝幹，搖勻，保證菌液搖勻)；
7)8000轉，1分鐘；去除超凈臺中的上清液，留下100-150 ul；
8)包被:37度孵育過夜；(平板是含有氨芐青黴素的固體LB培養基)
第壹層:X-gar 35ul
IPTG 25ul
後塗層:懸浮
過夜後，可以在板上看到許多藍色或白色的斑點。以白點為例，尤其是藍點周圍的白點，自鏈接率較低。
3.取壹些白點，把它們計劃在新的板上。
新電路板:首次塗漆:X-gar 35ul
IPTG 25ul
然後在板子底部畫壹個隔斷，並做上標記。根據需要，壹塊板做50個克隆體壹般沒問題。
針選擇白點並在板上的相應區域標記2條泳道。
37度，保溫箱過夜。
4.聯系測序公司發送測序。壹般壹個克隆定位在35-45元。
此部分的詳細信息:
1:塗層要均勻，Xgar和IPTG要均勻分布在板面上；
2.不要讓藍白色的斑點長得太滿，否則很容易壹下子選兩個克隆體。