文章題目： Programme of self-reactive innate-like T cell-mediated cancer immunity
發表時間及期刊：2022年4月20日 發表在 Nature 期刊
影響因子： 2020/2021: 49.962
主要內容： 在小鼠乳癌模型（PyMT）發現壹種新型細胞 先天性殺傷型 T 細胞 （Killer Innate-like T cell， ILTCK）。
這類細胞的特點：
1. 和傳統 CD8 T 細胞壹樣都表達 T 細胞受 體 （T cell receptor，TCR），但其激活不依賴樹突細胞（Dendritic Cell，DC），此特性使其更接近先天性淋巴細胞（Innate lymphoid cell）。
2. 不同於傳統 CD8 T 細胞，ILTCK 不表達 PD-1 和其他免疫抑制受體，因此不會進入細胞耗竭狀態，反而對腫瘤細胞有更強大的細胞毒性（cytotoxicity）。
3. 大部分的傳統 T 細胞識別腫瘤新抗原，而 ILTCK 識別腫瘤 原生抗原 ，並且具有顯著的組織駐留性（tissue residency）。
研究結果：
1. ILTCKs有壹個獨特的轉錄組
為了研究腫瘤浸潤性T細胞之間的異質性，我們對來自MMTV-PyMT(PyMT)小鼠乳腺腫瘤組織的CD45+TCRβ+CD8α+細胞進行了單細胞rna測序(scRNA-seq)分析，得到5個不同的簇。主要的marker基因如下：
進壹步的進行軌跡推斷，我們觀察到初始/最近激活的(C1)細胞和耗盡的(C2)細胞之間的大量混合(圖1d，e)，反映了由慢性刺激驅動的表型變化。相比之下，αβILTCKs（C3）和增殖（C5）細胞與C1分離的距離更遠（圖1d，e）。在校正了“細胞周期效應”後，最近激活向αβILTCK過渡的假設軌跡仍然與最近激活到耗盡的T細胞分化途徑不同(擴展數據圖2a，b)。因此， C1細胞要麽通過壹種獨特的分化途徑產生C3細胞，要麽不是它們的祖細胞。 高表達αβILTCK基因特征的腫瘤浸潤性c3樣CD8α+T細胞簇在PyMT乳腺腫瘤和小鼠前列腺癌模型(擴展數據圖2c-h)以及人類結直腸癌4(擴展數據圖2i-k)中重復存在， ***同表明αβILTCK分化程序代表了壹種進化上保守的腫瘤引起的免疫反應。
2. ILTCKtcr可以識別未突變的腫瘤抗原
為了探究腫瘤駐留的NK1.1+CD8α+αβILTCKs與傳統的PD-1+CD8α+T細胞(PD-1+T細胞)有何不同，我們獲得了每個子集使用的配對tcr序列的圖譜(擴展數據圖3a，補充表1)。然而，來自NK1.1+αβILTCKs和PD-1+T細胞的TCR之間的互補決定區3(CDR3)長度相似(擴展數據圖3b)。值得註意的是，我們沒有檢測到NK1.1+αβILTCKs和PD-1+T細胞所使用的任何TCR對， 這表明它們不是由壹個***同的祖細胞發展而來的。
為了確定每個亞群的TCR的特異性，我們使用改進的TCR報告檢測系統對它們對原發性PyMT癌細胞進行了反應分析(圖2b，擴展數據圖3c，補充表2)。33個NK1.1+αβILTCK衍生的tcr中有26個（78.8%）對異源癌細胞表現出顯著的反應性(圖2c) 怎麽得到的表 ，表明它們識別來自多個小鼠的癌細胞***享的未突變抗原。相比之下，沒有壹種PD-1+T細胞來源的TCR的反應超過了無關的OT-ITCR建立的背景水平(圖2c)， 這意味著它們對個體腫瘤特異性新抗原有反應。
當癌細胞缺乏經典的主要組織相容性復合體I類(MHC-I)編碼基因 （H2-K1和H2-D1） 或所有MHC-I分子的 專性亞基B2m 時，這種反應性喪失。 這表明αβILTCKtcr與它們的CD8+T細胞壹樣，主要局限於經典的MHC-I。
為了測試αβILTCKTCR是否識別MHC-I分子，而不管肽序列，我們使用PyMT腫瘤來源的癌細胞系缺乏內質網肽轉運體TAP1，因此具有幾乎無法檢測到的表面MHC-I水平(擴展數據圖4f)。Siinfekl肽穩定的MHC-I表達不足以激活αβILTCKTCRs(擴展數據圖4g，h)， 表明這些TCRs識別特定的肽-MHC-I復合物，而不是MHC-I分子本身。
3. ILTCKs are agonistically selected
為了研究傳統的CD8+T細胞是否會產生NK1.1+αβILTCKs，我們在CD8+T細胞中將內源性重排的TCR替換為αβILTCK衍生的TCR(擴展數據圖5a-e)。在過繼轉移到攜帶腫瘤的受體小鼠中(圖2d)後，表達αβILTCK衍生TCR的CD8+T細胞顯示PD-1表達上調，而NK1.1表達不上調(圖2e，f，擴展數據圖5f)。此外，傳統的CD8+T細胞反應需要BATF3-和irf8依賴的傳統1型樹突狀細胞(cDC1s)啟動，而腫瘤內NK1.1+αβILTCK反應獨立於cDC1s（擴展數據圖6）。 這些發現表明，αβILTCKs獨立於次級淋巴器官中樹突狀細胞介導的啟動，並具有與傳統CD8+T細胞不同的本體論。事實上，在腫瘤中，表達αβILTCK衍生TCRs的胸腺細胞發育中，持續且特異性地產生NK1.1+αβILTCKs，而不是PD-1+T細胞 (圖2g-i，擴展數據圖7a-c)。因此，NK1.1+αβILTCK和PD-1+T細胞代表了兩種相互排斥的細胞命運選擇，在胸腺細胞發育過程中，任何壹種細胞系都可能以tcr特異性依賴的方式發生。
而具有多克隆TCR庫的胸腺細胞主要產生常規的CD4或CD8單陽性T細胞(圖3a，b)，而含有單克隆αβILTCKTCR的胸腺細胞 只產生CD4-/loCD8-/lo細胞 (圖3a，b，擴展數據圖7d，e)。到目前為止，所有已知的TCRαβ+T細胞在發育過程中都在胸腺中經歷了CD4+CD8+雙陽性階段。與預期的壹樣，腫瘤駐留的NK1.1+αβILTCKs和PD-1+T細胞，而不是CD19+B細胞，被Rorc-cre等位基因壹致定位，該等位基因在CD4+CD8+胸腺細胞中瞬時活躍(擴展數據圖7f，g)。然而，與其他先天T細胞，如不變的自然殺手T(iNKT)細胞，由高表達的轉錄因子Zbtb，NK1.1+ αβILTCKs 沒有命運映射Zbtb16-cre-Rosa26LSL-YFP等位基因(擴展數據圖7h，我)，可能由於缺乏經典的MHC-I表達CD4+CD8+胸腺細胞。
經陽性選擇後，CD4+CD8+胸腺細胞瞬時表達低水平的PD-1。相比之下，表達αβILTCK-TCR的胸腺細胞保持了較高的PD-1表達(擴展數據圖7j，k)，表明其有強烈的TCR刺激的歷史。事實上，33個αβILTCK衍生的TCR中有23個（69.7%）對胸腺上皮細胞皮系表現出大量的反應性，其水平超過OT-ITCR，驅動了傳統CD8+T細胞的陽性選擇(擴展數據圖7l，數據未顯示)。這些發現表明， 強烈的自身反應性驅動αβILTCK譜系承諾，類似於指定iNKT細胞和腸道上皮內淋巴細胞(IEL)命運的“激動劑”選擇過程。
為了區分造血間質和耐輻射基質間在介導αβILTCK選擇中的作用，我們以野生型或B2m-/-小鼠為受體，生成了TCR-“逆轉錄”小鼠。B2m-/-受體的胸腺αβILTCK祖細胞室未改變（擴展數據圖7m），但僅在造血室B2m消融輕度減少，B2m消融顯著減少（擴展數據圖7n）。因此，αβILTCKs的激動劑選擇信號由輻射敏感的造血和抗輻射的間質室冗余提供。
4. ILTCKs continually repopulate tumours
不斷地再生腫瘤
大量攜帶αβILTCK-tcr的胸腺細胞***同表達PD-1和CD122(擴展數據圖7j，k)，這壹表型讓人聯想到IEL承諾的胸腺祖細胞。事實上，表達αβILTCK腫瘤tcr的胸腺細胞除了瘤內αβILTCKs外，還分化為小腸IELs，兩個群體都表達CD8αα同型二聚體(擴展數據圖8a-c)。在過繼轉移到淋巴細胞減少的腫瘤小鼠，多克隆TCRβ+CD4-/loCD8-/loPD-1+CD122+胸腺祖細胞既產生瘤內αβILTCKs，也產生腸道IELs(圖3c，d，擴展數據圖8d，e)。然而，在淋巴細胞豐富的小鼠中，αβILTCK和IEL祖細胞移植到腫瘤中，而不是在小腸中(圖3c，d)。為了進壹步探索腫瘤內αβILTCK和腸道IEL再生的動態，我們使用了Fgd5-creER-Rosa26LSL-tdTomato等位基因，其中他莫昔芬脈沖標記了部分造血幹細胞26，能夠穩定跟蹤其後代(擴展數據圖8f)。在Lin?-KIT+SCA1+骨髓幹細胞中，有20%的標記效率，大約3%的胸腺αβILTCK/IEL祖細胞被命運定位，類似於成年小鼠的CD4+CD8+、CD4或CD8單陽性和iNKT細胞室(擴展數據圖8g-i)。相比之下，小腸CD8αα+IELs的標記能力可以忽略不計(擴展數據圖8k，l)，證實了早期播種和原位增殖是其種群維持的主要手段27。因此，腫瘤內αβILTCK室，而不是腸道IEL室，不斷由胸腺祖細胞補充。
5. FCER1G的表達標誌著ILTCK譜系
為了深入了解ILTCK譜系的特征，我們將腫瘤浸潤性NK1.1+αβILTCKs和PD-1+T細胞與其各自的胸腺祖細胞進行了比較(擴展數據圖9a)。在αβILTCK祖細胞中上調但在成熟祖細胞中被抑制的基因在與抗原刺激相關的基因中富集，包括Tox-Pdcd1程序(擴展數據圖9b，補充表3)，反映了激動劑選擇事件。αβILTCK祖細胞中Lat和Cd2的下調可能會抑制TCR信號傳導，使成熟的αβILTCKs不容易被耗盡(擴展數據圖9c，補充表3)。值得註意的是，編碼許多NK受體和信號分子的基因在αβILTCK祖細胞中表達上調(擴展數據圖.9d，補充表3)，並在成熟的NK1.1+αβILTCKs8中保持高表達。相比之下，與末端效應分化和組織駐留計劃相關的途徑，包括Gzmc、Itga1和Itgae，可能是通過響應局部腫瘤微環境特異性信號而獲得的(擴展數據圖9e，補充表3)。
雖然承諾的αβILTCK祖細胞的過繼轉移持續產生NK1.1+αβILTCKs，但仍有相當壹部分是NK1.1?細胞(圖3c)。這不太可能是αβILTCK祖細胞之間預先存在的TCR異質性的結果，因為表達單克隆TCR的胸腺細胞也產生了NK1.1?和NK1.1+亞群(圖2g-i，擴展數據圖7b，c)。與PD-1+T細胞相比，NK1.1-細胞在轉錄上更類似於NK1.1+αβILTCKs(擴展數據圖9f)，但它們在胸腺αβILTCK祖細胞中富集的轉錄本表達更高，包括Pdcd1（補充表4）。與終末效應分化相關的基因，包括Gzmc，在獲得NK1.1時***同上調（補充表4）。因此，NK1.1標記激活了αβILTCKs，可能不能識別腫瘤中所有的αβILTCK細胞譜系。
scRNA-seq實驗顯示，在小鼠的癌癥模型中，Fcer1g在轉錄定義的αβILTCK簇(C3)中存在差異表達(擴展數據圖。1,9g，h)，並標記了壹個在結腸直腸癌患者的腫瘤組織中與小鼠αβILTCKs轉錄相似的C3亞群(擴展數據圖。2i–k, 9i).這些觀察結果表明，Fcer1g可能是壹個保守的αβILTCK譜系定義標記。事實上，FCER1G蛋白已經上調承諾PD-1hiCD122hi胸腺αβILTCK祖細胞，但不是在CD8單陽性細胞，並繼續表達腫瘤浸潤NK1.1+αβILTCKs而不是PD-1+T細胞(擴展數據圖9j，k)，表明FCER1G具體和穩定標記細胞致力於αβILTCK血統。
在CD4?CD8α?TCRβ+CD1d?NK1.1?胸腺細胞中，FCER1G+CD122+群體表達高水平的PD-1，缺乏顆粒酶B(GZMB)表達，表型與CD122和PD-1***同表達的αβILTCK和IEL祖細胞相同(圖4a，b)。在腫瘤浸潤性T細胞中，FCER1G+CD122+群體仍然是CD4?，其中大多數上調CD8αα同型二聚體(擴展數據圖9l，m)，並且壹致缺乏PD-1的表達(圖4a，b)。值得註意的是，FCER1G+CD122+T細胞中同時含有NK1.1+GZMB+/?αβILTCKs和它們未成熟的NK1.1?GZMB?前體(圖4a，b)。因此，FCER1G的表達可以充分識別腫瘤浸潤性αβILTCKs，而不管其激活狀態如何。
在結腸癌患者中，FCER1G+TCRβ+細胞也很容易在腫瘤組織中檢測到(擴展數據圖9n)，其***受體表達譜與小鼠相似(擴展數據圖9n，o)。FCER1G+T細胞相對於鄰近的正常結腸在腫瘤組織中富集(圖4c，d)，與PD-1+相比，它們表達了更高水平的GZMB(圖4e)。總的來說，這些發現確定了FCER1G作為αβILTCK譜系定義標記，並證明αβILTCK程序在小鼠和人類中代表了壹種進化上保守的腫瘤引起的免疫反應。
6.ILTCK可被設計用於癌癥治療
與之前的研究表明NK1.1+αβILTCKs嚴重依賴於促炎細胞因子IL-15相壹致，我們在缺乏Il15的小鼠中觀察到FCER1G+CD122+胸腺αβILTCK祖細胞幾乎完全缺失(圖5a，b)。因為IL-15在兩者中都有表達淋巴組織和非淋巴組織，驅動腫瘤內αβILTCKs的擴張和激活的IL-15的確切來源尚不清楚。在造血細胞系中消融Il15並沒有損害腫瘤引起的αβILTCK反應（數據未顯示）。值得註意的是，與健康的乳腺組織相比，轉化的乳腺上皮細胞中IL-15的表達明顯增加(圖5c)。IL-15在結腸癌患者的腫瘤上皮細胞中也很容易被檢測到(擴展數據圖10a)，而FCER1G+的頻率，而不是PD-1+，T細胞與IL-15水平呈正相關(圖5d，擴展數據圖10a，b)。
為了研究癌細胞表達的IL-15是否調節αβILTCK反應，我們使用了S100a8-cre-Il15fl/flPyMT小鼠，這些小鼠中Il15在轉化中缺失，但在健康的乳腺上皮中沒有缺失(擴展數據圖10c，數據未顯示)。S100a8-cre-Il15fl/flPyMT小鼠的胸腺FCER1G+CD122+αβILTCK祖細胞水平相似(圖5e，f)。值得註意的是，與對照組相比，S100a8-cre-Il15fl/flPyMT小鼠中腫瘤浸潤性αβILTCKs明顯減少，而殘留的αβILTCKs中NK1.1和GZMB的表達明顯減少(圖5e，f)。值得註意的是，與野生型對照組相比，S100a8-cre-Il15fl/flPyMT小鼠表現出加速的腫瘤生長(圖5g)。這些發現表明，ILTCKs可以感知癌細胞來源的IL-15，用於癌癥免疫監測。
值得註意的是，IL-15足以在胸腺αβILTCK祖細胞中誘導NK1.1和GZMB的上調，以及伴隨的PD-1的下調(擴展數據圖10d)。為了測試異位激活IL-15信號是否在過繼轉移的αβILTCK祖細胞可以抑制腫瘤的發展，我們從Ubc-creER-Rosa26LSL-Stat5b-CA/+小鼠中純化胸腺αβILTCK祖細胞，其中他莫昔芬誘導轉錄因子STAT5B(STAT5B-CA)的表達，主要協調IL-15信號下遊的轉錄程序31(擴展數據圖10e)。在過繼轉移到淋巴細胞缺陷的腫瘤攜帶PyMT小鼠後，STAT5B-CA的誘導表達導致轉移細胞擴增60倍，四周內NK1.1和GZMB均勻上調(擴展數據圖10f-i)。重要的是，與對照組αβILTCKs或無細胞轉移的小鼠相比，接受STAT5B-ca武裝αβILTCKs的小鼠表現出明顯的腫瘤生長抑制作用(擴展數據圖10j)。
當過繼轉移到充滿淋巴細胞的PyMT宿主時，STAT5B-ca武裝的αβILTCK祖細胞很容易定植腫瘤組織，並經歷了強大的擴增和效應分化，導致腫瘤生長減少(圖5h-j，擴展數據圖10k)。相比之下，過繼轉移的STAT5B-ca武裝的胸腺CD8單陽性T細胞沒有移植或分化，可能是由於腫瘤反應性克隆的頻率較低，並且預期腫瘤生長沒有改變(圖5h-j)。因此，αβILTCK中的IL-15信號軸可以成為開發癌癥治療方法的壹個強大的和可利用的底物。
Discussion
在這項研究中，我們建立了FCER1G+αβILTCK程序，作為壹種獨特的和進化保守的腫瘤誘導的T細胞反應，並確定癌細胞來源的IL-15是其抗腫瘤作用的必要和充分驅動因素。由於FCER1G為多個NK受體提供了必要的激活基序，其在胸腺αβILTCK祖細胞中的早期表達可能增強其在腫瘤組織中NK受體上調時效應功能的快速獲得。雖然FCER1G也特異性地標記了人類腫瘤浸潤性αβILTCK樣細胞的壹個亞群，但在部分循環的人CD8+T細胞中，延長IL-15暴露可以誘導FCER1G32。可以想象，FCER1G的表達在人類αβILTCKs中可能比在小鼠αβILTCKs中更動態地調控。另外，FCER1G可能標記除人類αβILTCK之外的其他譜系，其解決方案需要進壹步的研究。盡管廣泛表達腫瘤反應性tcr，但il-15激活的αβILTCKs8的細胞毒性是不可必要的。