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蛋白質的氧化峰需要預處理才能出來嗎?

要回答這個問題,我們需要了解樣品預處理的目的:減少人為的降解和修飾,釋放盡可能多的多肽。

整個過程可以分為以下幾個程序:首先從組織、體液或細胞中提取蛋白質,得到蛋白質混合溶液(根據妳的研究目的,可以先分離蛋白質,也可以不分離),然後進行還原性烷基化(還原的過程是打開蛋白質的二硫鍵,然後烷基化可以修飾巰基,防止遊離巰基再次生成二硫鍵),進行酶解,得到肽段。

1,樣品的收集和保存

組織樣本

1)對於人體切除的組織,如果可能的話,最好用PBS(磷酸鹽緩沖鹽水溶液,作為溶劑,起到溶解保護試劑的作用)取後直接去血。如果血液沒有去除,可以保存在-80℃的液氮中,用幹冰運輸。

2)對於小鼠、大鼠、兔等組織樣本,建議采用灌註去血,尤其是肝臟、胃、心臟等大組織,可以直接去血,得到最幹凈的血液。第二個方案是後期切的時候去血。

細胞樣本

對於常規實驗,建議接收大於5*1E6~1E7細胞的樣本量(有些實驗會要求更少的樣本量,後面會詳細討論)。取細胞後,先用PBS清洗細胞表面,因為培養基中大部分含有血清,所以這部分血清需要先清洗~

如果是做分泌蛋白的研究,首先要用PBS洗幾次樣品,然後在條件培養基(無血清培養基)中培養。根據細胞情況,大約12小時後,我們可以通過離心提取分泌蛋白,去除細胞碎片,取上清液。

血清樣本

1)血漿樣本:可通過常用的EDTA抗凝管采集,采集的血漿會懸浮,離心去除血細胞。

2)血清樣本:目前大部分研究都是針對血清樣本,成分更簡單,不含凝集素和大量血細胞,針對性更強。采集血清樣本時,直接將血清吸入試管中,讓其在室溫下凝固。上清液的黃色部分是血清樣本。

2、研磨或超聲波粉碎樣品,為了減少人工操作引入的修飾,通常要準備大量的冰,在冰上操作。同時需要加入蛋白酶抑制劑,防止操作過程中蛋白質被樣品中的蛋白酶降解。

3.完全焊接蛋白質。如果蛋白質沒有完全溶解,可以提取的蛋白質就很少,研究目的就達不到。

4、完全解旋蛋白質,通常情況下,蛋白質處於球狀穩定狀態,解旋蛋白質是將球狀蛋白質中的二硫鍵打開,使其形成鏈狀結構,從而進行下壹步的酶消化。

5.蛋白質的酶促水解通常,蛋白質被各種酶酶促水解。

6、去除雜質,要知道質譜是壹種非常靈敏的儀器,它檢測的是多肽的質荷比。所有的鹽以及所有離子化的雜質都會幹擾肽段的檢測。因此,我們會要求蛋白質樣品在進入質譜之前非常幹凈。在蛋白質水平和肽水平上去除雜質。

更詳細的,下次再聊~

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