為了作為啟動轉錄和復制的功能模板，流感病毒RNA（vRNA）必須通過聚合酶復合物轉錄為正義mRNA，其中包括三種病毒聚合酶（PB2，PB1和PA） 和核蛋白（NP）。流感病毒具有由8個RNA基因區段組成的基因組，必須對其進行表達和包裝以完成病毒復制周期。
流感病毒的反向遺傳系統於1999年由兩個不同的研究小組建立，依靠細胞內RNA聚合酶I（PolⅠ）合成流感病毒RNA。RNA聚合酶I是壹種豐富的核酶，可轉錄核糖體RNA。RNA聚合酶I在確定的啟動子和終止子序列處起始並終止轉錄，並且所得的轉錄物在5'或3'末端不含有額外的核苷酸。因此，這種酶非常適合在細胞核中產生流感病毒vRNA。雖然流感病毒拯救系統在不斷完善提高，但使用RNA聚合酶I系統合成vRNA的基本概念仍然相同。
目前，流感病毒的重新合成主要通過用8-12個質粒***轉染細胞來實現。其中，8質粒系統拯救甲型流感病毒最為廣泛。8種質粒含有編碼RNA聚合酶I可識別的啟動子和終止子，在啟動子和終止子之間分別含有每條流感病毒分段基因組的cDNA。8質粒系統的蛋白質由PolⅡ轉錄翻譯，且此系統至少需要表達4種蛋白（PA, PB1, PB2和NP）。壹般的8質粒系統可轉錄流感病毒的8個基因，翻譯流感病毒的10個蛋白。翻譯完整的流感病毒蛋白，能夠提高流感病毒的拯救效率。
protocol：
克隆8質粒：
使用含人類 polⅠ序列的 載體作為拯救系統的表達載體，構建8質粒拯救系統。此載體為雙向雙表達載體，在polⅡ啟動子(CMV)和終止序列(SV40)之間反向插入了人類polⅠ啟動子和鼠polⅠ終止序列。將流感病毒的8個cDNA（包括UTR和ORF）插入該載體，轉染細胞後，polⅠ負責合成流感病毒單股負鏈RNA，polⅡ負責轉錄流感病毒正鏈mRNA，隨後翻譯流感病毒蛋白。該質粒較特殊，在插入片段的前後均有polyA尾，無法用通用引物測序，需要使用每個基因的特異性引物進行測序。
拯救甲型流感病毒：
1. 將HEK-293T接種到6孔板中，培養24小時至少95% confluence。
註：因轉染會加入大量的有毒性轉染試劑，故細胞狀態需要良好、數量需求較多。由於人類polⅠ啟動子的物種特異性，只能使用具有高轉染效率的靈長類動物來源的細胞（293T或Vero細胞）進行流感病毒的包裝。壹般來說，293T拯救效果強於Vero。由於MDCK細胞支持許多流感病毒的生長，並且可以在與293T細胞相同的培養基中生長，因此***培養的293T-MDCK細胞（1：1）可用於提高某些流感病毒株的拯救效率。
2. 在DMEM培養基（不含FBS）中，每個質粒1μg，8個質粒***計8μg，與轉染試劑混合，室溫下靜止15-30分鐘。
註：質粒：脂質體=1：3；質粒：PEI=1：4。DMEM可換成Opti-MEM。
3. 更換HEK-293T的DMEM培養基（含FBS），將質粒-轉染試劑復合體緩緩滴入6孔板中。
4. 將細胞放於含5%二氧化碳的37℃培養箱中培養。
註：35℃環境也可。
5. 轉染後24小時，加入終濃度為1μg/ml的TPCK處理過的胰酶，繼續培養。
註：TPCK胰酶用於切割流感病毒的HA蛋白，使病毒具有感染性。某些病毒株可不用此胰酶。
6. 轉染後48小時或72小時後，收集HEK-293T細胞上清液。此時，流感病毒即在上清液中，但是滴度極低。
註：反復凍融3次細胞有助於細胞內的流感病毒釋放。
7. 將收集的上清液滴入MDCK細胞中，流感病毒感染MDCK細胞以擴增。
註：同樣需要加入終濃度為1μg/ml的TPCK處理過的胰酶。用雞胚培養流感病毒效果極佳：接種到9-11天齡的SPF雞胚胎中。孵育48小時後收獲羊膜尿囊液。感染性病毒的存在可通過血凝素（HA）試驗確認。
8. 感染後48小時，收集MDCK細胞上清液，進行plaque assay進行病毒滴度的測定。
註：壹般測出的滴度處於5x10^6Pfu/ml左右。若想增加流感病毒滴度，繼續將病毒感染MDCK以進行擴增。
9. 應通過對8個病毒基因片段中的每壹個進行測序來確認拯救病毒的身份。
10. 病毒液可在4℃存放數周。-80℃可長期儲存。
參考資料：
1. 劉麗琦. HgN2 禽流感病毒致病性的初步研究及反向遺傳系統的構建[D]. 中國疾病預防控制中心, 2009.
2. Lee C W. Reverse genetics of influenza virus[M]//Animal Influenza Virus. Humana Press, New York, NY, 2014: 37-50.