為了作為啟動轉錄和復制的功能模板,流感病毒RNA(vRNA)必須通過聚合酶復合物轉錄為正義mRNA,其中包括三種病毒聚合酶(PB2,PB1和PA) 和核蛋白(NP)。流感病毒具有由8個RNA基因區段組成的基因組,必須對其進行表達和包裝以完成病毒復制周期。
流感病毒的反向遺傳系統於1999年由兩個不同的研究小組建立,依靠細胞內RNA聚合酶I(PolⅠ)合成流感病毒RNA。RNA聚合酶I是壹種豐富的核酶,可轉錄核糖體RNA。RNA聚合酶I在確定的啟動子和終止子序列處起始並終止轉錄,並且所得的轉錄物在5'或3'末端不含有額外的核苷酸。因此,這種酶非常適合在細胞核中產生流感病毒vRNA。雖然流感病毒拯救系統在不斷完善提高,但使用RNA聚合酶I系統合成vRNA的基本概念仍然相同。
目前,流感病毒的重新合成主要通過用8-12個質粒***轉染細胞來實現。其中,8質粒系統拯救甲型流感病毒最為廣泛。8種質粒含有編碼RNA聚合酶I可識別的啟動子和終止子,在啟動子和終止子之間分別含有每條流感病毒分段基因組的cDNA。8質粒系統的蛋白質由PolⅡ轉錄翻譯,且此系統至少需要表達4種蛋白(PA, PB1, PB2和NP)。壹般的8質粒系統可轉錄流感病毒的8個基因,翻譯流感病毒的10個蛋白。翻譯完整的流感病毒蛋白,能夠提高流感病毒的拯救效率。
protocol:
克隆8質粒:
使用含人類 polⅠ序列的 載體作為拯救系統的表達載體,構建8質粒拯救系統。此載體為雙向雙表達載體,在polⅡ啟動子(CMV)和終止序列(SV40)之間反向插入了人類polⅠ啟動子和鼠polⅠ終止序列。將流感病毒的8個cDNA(包括UTR和ORF)插入該載體,轉染細胞後,polⅠ負責合成流感病毒單股負鏈RNA,polⅡ負責轉錄流感病毒正鏈mRNA,隨後翻譯流感病毒蛋白。該質粒較特殊,在插入片段的前後均有polyA尾,無法用通用引物測序,需要使用每個基因的特異性引物進行測序。
拯救甲型流感病毒:
1. 將HEK-293T接種到6孔板中,培養24小時至少95% confluence。
註:因轉染會加入大量的有毒性轉染試劑,故細胞狀態需要良好、數量需求較多。由於人類polⅠ啟動子的物種特異性,只能使用具有高轉染效率的靈長類動物來源的細胞(293T或Vero細胞)進行流感病毒的包裝。壹般來說,293T拯救效果強於Vero。由於MDCK細胞支持許多流感病毒的生長,並且可以在與293T細胞相同的培養基中生長,因此***培養的293T-MDCK細胞(1:1)可用於提高某些流感病毒株的拯救效率。
2. 在DMEM培養基(不含FBS)中,每個質粒1μg,8個質粒***計8μg,與轉染試劑混合,室溫下靜止15-30分鐘。
註:質粒:脂質體=1:3;質粒:PEI=1:4。DMEM可換成Opti-MEM。
3. 更換HEK-293T的DMEM培養基(含FBS),將質粒-轉染試劑復合體緩緩滴入6孔板中。
4. 將細胞放於含5%二氧化碳的37℃培養箱中培養。
註:35℃環境也可。
5. 轉染後24小時,加入終濃度為1μg/ml的TPCK處理過的胰酶,繼續培養。
註:TPCK胰酶用於切割流感病毒的HA蛋白,使病毒具有感染性。某些病毒株可不用此胰酶。
6. 轉染後48小時或72小時後,收集HEK-293T細胞上清液。此時,流感病毒即在上清液中,但是滴度極低。
註:反復凍融3次細胞有助於細胞內的流感病毒釋放。
7. 將收集的上清液滴入MDCK細胞中,流感病毒感染MDCK細胞以擴增。
註:同樣需要加入終濃度為1μg/ml的TPCK處理過的胰酶。用雞胚培養流感病毒效果極佳:接種到9-11天齡的SPF雞胚胎中。孵育48小時後收獲羊膜尿囊液。感染性病毒的存在可通過血凝素(HA)試驗確認。
8. 感染後48小時,收集MDCK細胞上清液,進行plaque assay進行病毒滴度的測定。
註:壹般測出的滴度處於5x10^6Pfu/ml左右。若想增加流感病毒滴度,繼續將病毒感染MDCK以進行擴增。
9. 應通過對8個病毒基因片段中的每壹個進行測序來確認拯救病毒的身份。
10. 病毒液可在4℃存放數周。-80℃可長期儲存。
參考資料:
1. 劉麗琦. HgN2 禽流感病毒致病性的初步研究及反向遺傳系統的構建[D]. 中國疾病預防控制中心, 2009.
2. Lee C W. Reverse genetics of influenza virus[M]//Animal Influenza Virus. Humana Press, New York, NY, 2014: 37-50.