壹種不對稱PCR擴增方法及其專用引物與應用
申請專利號 CN200410056866.0
專利申請日 2004.08.26
名稱 壹種不對稱PCR擴增方法及其專用引物與應用
公開（公告）號 CN1629305
公開（公告）日 2005.06.22
類別 化學；冶金
頒證日
優先權
申請（專利權） 北京博奧生物芯片有限責任公司;清華大學
地址 102206北京市昌平區生命科學園路18號
發明（設計）人 張治位;王璨;祝令香;張瓊;程京
國際申請
國際公布
進入國家日期
專利代理機構 北京紀凱知識產權代理有限公司
代理人 關暢
摘要
本發明公開了壹種不對稱PCR擴增方法及其專用引物與應用，目的是提供壹種能簡單、高效的制備單鏈擴增產物的PCR擴增方法。本發明所提供的不對稱PCR引物，包括若幹對PCR引物對，其特征在於：每對所述引物對中的壹條引物的5′末端均加有壹段與待擴增靶序列無關的寡核苷酸尾。所提供的不對稱PCR擴增方法，包括如下步驟：1)預變性；2)包括若幹變性、引物退火和引物延伸循環的第壹部分PCR擴增；3)包括若幹變性和引物延伸循環的第二部分PCR擴增。所述引物延伸中所用PCR引物對中的壹條引物的5′末端均加有壹段與待擴增靶序列無關的寡核苷酸尾。本發明的不對稱PCR擴增方法單鏈產率高，可進行單重或多重PCR擴增，在核酸檢測中可以得到廣泛應用。
主權項
1、壹種不對稱PCR引物，包括若幹對PCR引物對，其特征在於：每對所述引物對中的壹條引物的5′末端均加有壹段與待擴增靶序列無關的寡核苷酸尾。
PCR產物的直接測序
凝膠純化PCR擴增的靶序列
如果最佳PCR反應條件不能產生所需的特異性產物，可采用新的寡核苷酸重新進行擴增，或用凝膠電泳來分離不同的PCR產物，而後再各自重新擴增進行序列分析。長度不同的片段可以用瓊脂糖凝膠電泳來分離:
1.片段大小在80-100bp時，可采用3%NuSieve1%普通瓊脂糖或用聚丙烯酰胺膠來分離。
2.從膠上切下含所南非PCR片段的薄片。
3.加入50∽100μlTE浸泡膠片，可反復凍融或放置幾個小時使DNA從膠中擴散出來。
4.取少量(1-5%)進行第二次擴增，為得到純凈單壹的產物，用於第二次PCR擴增 的凝膠抽提物的量必須少於1ng。
5.現已發現瓊脂糖含有抑制Tab聚合酶活的物質。因而，如需重新擴增供Tab聚合酶測序用的片段，最好用丙烯酰胺電泳分離。
當用PCR引物擴增幾個同樣長度的相關序列時，如來自幾個新近復制的基因，或重復序列或保守的信號序列(conserved signal sequences)的同樣顯子，可以通過下列兩種不同方法來改進電泳分離。1).先用只切割某壹模板的內切酶進行酶切，而後電泳純化完整的PCR產物。2).用可使核苷酸序列不同的擴增產物分開的電泳系統。下壹個部份將討論此類系統中的變性甲酰胺梯度凝膠系統。采用方法壹時，必須事先了 解在不同PCR產物中的內切酶位點。
雜合體的直接測序
當兩個等位基因由於單壹位點突變而產生差異時，用壹個PCR引物直接進行測序，能找出雜合位點。但是，帶有幾個點突變或短片段的插入/缺失的等位模板用PC R引物之壹來直接測序，將產生復合序列帶(compound sequencing ladders)。有四種 方法可以確定幾種點突在型並從雜合體中獲得單個等位基因的序列:1).克隆分離不同 的模板;2).在測序之前，利用模板之間核苷酸序列的差異，用電泳技術分離不同的模 板;3).在測序反應中只啟動壹個等位基因;4).只擴增壹個等位基因。
測序模板的制備
與PCR產物的直接測序有關的壹些問題是變性後由於擴增片段的兩條鏈可以迅速結合起來，從而阻止了測序引物與它的互補序列退火，或阻止了引物──模板復合物的延伸。在測序反應中，模板鏈重新結合使壹小部份模析驂與測序從而弱化最終的測序條帶。為減少此問題，可用改進的標準雙鏈DNA測序法或用PCR制備單鏈模板。
雙鏈DNA模板
有兩種不同方法用來制備測序用的模板，目前都已用來測定***價閉環雙鏈質粒模板的序列。用這些方法來進行PCR產物的測序通常是較困騅的，因為短的線性模板比團環質粒的雙鏈更易於重新結合。在這兩種方法中，PCR片段可以由凝膠電膠或在電 泳前先進行旋轉透析(Spin-dialysis)純化。
1.在室溫下，模板先在0.2M NaOH中變性5分鐘，冰凍，加入0.4倍的5M醋酸銨 (pH7.5)來中和反應。立即用四體積的無水乙醇沈澱DNA。在合適的退火溫度下，加入 測序緩沖引物。
2.在95℃下保溫5分鐘來變性模板，冰浴(或在幹冰乙醇中)快速冷卻離心管，以 減少鏈的重新結合。加入測序引物並使反應達到合適的溫度。測序引物在變性前或後 加入都合適。
單鏈DNA模板
使用單鏈模板可以避免測序中鏈的重新結合。單鏈模板可以從雙鏈DNA模板經鏈分離凝膠中制備，或用PCR反應制備。大於500bp的單鏈DNA片段，可從瓊脂糖凝膠中分離笪到，但它不適合於更短的單鏈。制備單鏈DNA的另壹種不同方法是在PCR反應中使用壹個生物素標記的引物，變性後的PCR產物經過壹個親合素柱而使兩條鏈得到分離，只有生物素標記的鏈才可結合到柱上。然而，最簡單的方法是用改進的PCR方法，用此方法制備既定的單鏈DNA。在這個反應中(不對稱PCR，asymmetric PCR)，在開始的20-25個循環中，兩個比率不對稱的擴增引物產生出雙鏈DNA，當限量的那個引物耗光後，隨後的5-10個循環就產生出ssDNA。單鏈DNA在約在25個循環後開始出現，這時限量的引物也幾乎耗盡。經過壹個短暫快速上升後，ssDNA就開始如預期的那樣呈線性積累，這時反應中僅有壹個引物存在。各種比率的引物都以這種形式產生 ssDNA。壹般對100μlPCR反應體系而言，引物比率為50pmo:0.5pmol，經過30個循環後，大約可產生1-3pmol的ssDNA。ssDNA的產量可用下列幾種方法來估計:a)。在PCR 反應中，除了加入正常數量的dDNA外，還加入32P-dNTP。取10%的反應產物在薄的3% NuSieve+1%普通瓊脂糖凝膠中電泳，幹燥並與膠片壹起曝光。b).取5%的反應物來走膠，轉移到膜上，並用與ssDNA互補的寡核苷酸為探針雜交。ssDNA不能用EB染色來定量，因為ssDNA有形成二級結構的趨勢且染料的插入在模板中是隨機的。使用不對稱引物比例的擴增效率比兩種引物均過量80-90%)的擴增效率低(70%)。在實驗中，這可通過增加PCR循環的次數來彌補。若不對稱的PCR反應不能產生足夠數量的ssDNA，可以試壹試不同的引物比率;b).再加5-10個PCR循環;c).在最後五個循環中多加Tab聚合酶(2U);d).試壹下相反的不對稱引物比率。有時，相反的不對稱引物比率可能給出不同產量的ssDNA。制備出的單鏈DNA用限量的那個PCR引物或用壹個內引物來測序，並 應用常規方法進行摻入測序(incorporation sequencing)或標記引物測序。制備出的 ssDNA鏈可能有壹個不連續的5'-末端，但可能在靠近3'-末端不同位點處被切去，這是由於延伸過程中終止過早所產生的。然而，對於測序反應中所使用的任何壹種引 物，只有完整的ssDNA可以用作測序模板。
最近還報道了另壹種方法制備單鏈核酸模板進行直接測序。這種方法包括在壹個 PCR引物上加入噬菌體的啟動子，轉錄出該PCR產物的RNA拷貝，再用反轉錄酶不測序。但由於擴增反應後附加了壹個酶促反應步驟和限於用反轉錄酶作為測序酶，這種 方法的應用受到很大的限制。
雙鏈DNA模板
有兩種不同方法用來制備測序用的模板，目前都已用來測定***價閉環雙鏈質粒模板的序列。用這些方法來進行PCR產物的測序通常是較困騅的，因為短的線性模板比團環質粒的雙鏈更易於重新結合。在這兩種方法中，PCR片段可以由凝膠電膠或在電 泳前先進行旋轉透析(Spin-dialysis)純化。
1.在室溫下，模板先在0.2M NaOH中變性5分鐘，冰凍，加入0.4倍的5M醋酸銨 (pH7.5)來中和反應。立即用四體積的無水乙醇沈澱DNA。在合適的退火溫度下，加入 測序緩沖引物。
2.在95℃下保溫5分鐘來變性模板，冰浴(或在幹冰乙醇中)快速冷卻離心管，以 減少鏈的重新結合。加入測序引物並使反應達到合適的溫度。測序引物在變性前或後 加入都合適。
單鏈DNA模板
使用單鏈模板可以避免測序中鏈的重新結合。單鏈模板可以從雙鏈DNA模板經鏈分離凝膠中制備，或用PCR反應制備。大於500bp的單鏈DNA片段，可從瓊脂糖凝膠中分離笪到，但它不適合於更短的單鏈。制備單鏈DNA的另壹種不同方法是在PCR反應中使用壹個生物素標記的引物，變性後的PCR產物經過壹個親合素柱而使兩條鏈得到分離，只有生物素標記的鏈才可結合到柱上。然而，最簡單的方法是用改進的PCR方法，用此方法制備既定的單鏈DNA。在這個反應中(不對稱PCR，asymmetric PCR)，在開始的20-25個循環中，兩個比率不對稱的擴增引物產生出雙鏈DNA，當限量的那個引物耗光後，隨後的5-10個循環就產生出ssDNA。單鏈DNA在約在25個循環後開始出現，這時限量的引物也幾乎耗盡。經過壹個短暫快速上升後，ssDNA就開始如預期的那樣呈線性積累，這時反應中僅有壹個引物存在。各種比率的引物都以這種形式產生 ssDNA。壹般對100μlPCR反應體系而言，引物比率為50pmo:0.5pmol，經過30個循環後，大約可產生1-3pmol的ssDNA。ssDNA的產量可用下列幾種方法來估計:a)。在PCR 反應中，除了加入正常數量的dDNA外，還加入32P-dNTP。取10%的反應產物在薄的3% NuSieve+1%普通瓊脂糖凝膠中電泳，幹燥並與膠片壹起曝光。b).取5%的反應物來走膠，轉移到膜上，並用與ssDNA互補的寡核苷酸為探針雜交。ssDNA不能用EB染色來定量，因為ssDNA有形成二級結構的趨勢且染料的插入在模板中是隨機的。使用不對稱引物比例的擴增效率比兩種引物均過量80-90%)的擴增效率低(70%)。在實驗中，這可通過增加PCR循環的次數來彌補。若不對稱的PCR反應不能產生足夠數量的ssDNA，可以試壹試不同的引物比率;b).再加5-10個PCR循環;c).在最後五個循環中多加Tab聚合酶(2U);d).試壹下相反的不對稱引物比率。有時，相反的不對稱引物比率可能給出不同產量的ssDNA。制備出的單鏈DNA用限量的那個PCR引物或用壹個內引物來測序，並 應用常規方法進行摻入測序(incorporation sequencing)或標記引物測序。制備出的 ssDNA鏈可能有壹個不連續的5'-末端，但可能在靠近3'-末端不同位點處被切去，這是由於延伸過程中終止過早所產生的。然而，對於測序反應中所使用的任何壹種引 物，只有完整的ssDNA可以用作測序模板。
最近還報道了另壹種方法制備單鏈核酸模板進行直接測序。這種方法包括在壹個 PCR引物上加入噬菌體的啟動子，轉錄出該PCR產物的RNA拷貝，再用反轉錄酶不測序。但由於擴增反應後附加了壹個酶促反應步驟和限於用反轉錄酶作為測序酶，這種 方法的應用受到很大的限制。