真核細胞與原核細胞在基因轉錄,翻譯及DNA的空間結構方面存在如下差異:
1,真核細胞中,壹條成熟的mRNA鏈只能翻譯出壹條多肽鏈,原核生物中常見的多基因操縱子形式在真核細胞中比較少見。
2,真核細胞的DNA組蛋白和大量非組蛋白結合,只有壹小部分DNA是裸露的。
3,高等真核細胞DNA中大部分不轉錄,真核細胞中有壹部分由幾個或幾十個堿基組成的DNA序列,在整個基因組中重復幾百次甚至上百萬次。此外,大部分真核細胞的基因中間還存在不被翻譯的內含子。
4,真核生物能夠有序地根據生長發育階段的需要進行DNA片段重排,還能在需要時增加細胞內某些基因的拷貝數,這種能力在原核生物中極為罕見。
5,原核生物中,轉錄的調節區都很小,大都位於轉錄起始位點上遊不遠處,調控蛋白結合到調節位點上可直接促進或抑制RNA聚合酶對它的結合。真核生物中,基因轉錄的調節區則大得多,它們可能遠離核心啟動子幾百個甚至上千個堿基對。雖然這些調節區也能與蛋白質結合,但是並不直接影響啟動子區對與RNA聚合酶的接受程度,而是通過改變整個所控制基因5'上遊區DNA構型來影響它與RNA聚合酶的結合能力。
6,真核生物的RNA在細胞核中合成,只有經轉座穿過核膜,到達細胞質基質後,才能被翻譯成蛋白質。原核生物中不存在這樣嚴格的空間間隔。
7,許多真核生物的基因只有經過復雜的成熟和剪接過程,才能被順利地翻譯成蛋白質。
基因轉錄調節的基本要素包括順式作用元件(coding region),反式作用因子(trans-acting factor)和RNA聚合酶(RNA polymerase)。
順式作用元件是指啟動子和基因的調節序列。主要包括啟動子,增強子(enhancer),沈默子(silencer)等。反式作用因子是指能夠結合在順式作用元件上調控基因表達的蛋白質或者RNA。原核生物只有壹種RNA聚合酶,真核生物有3種RNA聚合酶,催化轉錄不同的RNA產物。由於真核生物3種RNA聚合酶中,只有RNA聚合酶Ⅱ能夠轉錄信使RNA前體,並在加工成熟後按照三聯子密碼的原理翻譯成蛋白質產物,我們這裏主要討論RNA聚合酶Ⅱ的基因轉錄及其調控過程。
真核基因啟動子由核心啟動子和上遊啟動子兩部分組成,是在基因轉錄起始位點(+1)及其5'上遊100~200bp以內的壹組具有獨立功能的DNA序列,每個元件長度為7~20bp,是決定RNA聚合酶Ⅱ轉錄起始位點和轉錄頻率的關鍵元件。
1,核心啟動子(core promoter)是指保證RNA聚合酶Ⅱ轉錄正常起始所必需的,最少的DNA序列,包括轉錄起始位點及轉錄起始位點上遊-25~-30bp處的TATA區。核心啟動子單獨起作用時,只能確定轉錄起始位點並產生基礎水平的轉錄。
2,上遊啟動子元件(upstream promoter element , UPE)? 包括通常位於-70 bp附近的CAAT區(CCAAT)和GC區(GGGCGG)等,能通過TF Ⅱ D復合物調節轉錄起始的頻率,提高轉錄效率。
包括從轉錄起始位點到RNA聚合酶Ⅱ轉錄終止處的全部DNA序列。
RNA聚合酶Ⅱ是壹類能夠直接或間接與啟動子核心序列TATA區特異結合,並啟動轉錄的調節蛋白。RNA聚合酶Ⅱ在轉錄因子幫助下形成轉錄起始復合物。RNA聚合酶Ⅱ由至少10~12個亞基組成,各亞基的相對分子質量在1X10^4~2.4X10^5,有些亞基也在聚合酶Ⅰ,Ⅲ中***用。
4,RNA聚合酶Ⅱ基礎轉錄所需的蛋白質因子(以"TF Ⅱ"表示)在生理條件下,RNA聚合酶Ⅱ基礎轉錄所需的蛋白質因子形成轉錄起始復合物。TF Ⅱ D,TF Ⅱ B,和TF Ⅱ F與RNA聚合酶Ⅱ可在啟動子上形成最初級復合物,開始轉錄mRNA,加入TF Ⅱ E和TF Ⅱ H後形成完整的轉錄復合物並轉錄出長鏈RNA,加入TF Ⅱ A可進壹步提高轉錄效率。RNA聚合酶Ⅱ沿著模板滑動時TF Ⅱ D及TF Ⅱ A滯留在轉錄起始位點上,其他因子隨聚合酶向模板DNA的3'端移動。關於RNA聚合酶Ⅱ如何整合成為轉錄起始復合物從而發揮作用,目前有兩種假說,壹種認為是壹步結合,另壹種認為是分步結合。
增強子是指能使與它連鎖的基因轉錄頻率明顯增加的DNA序列。
真核生物啟動子和增強子是由若幹DNA序列元件組成的,由於它們常與特定的功能基因連鎖在壹起,因此被稱為順式作用元件。這些序列組成基因轉錄的調控區,影響基因的表達。在轉錄調控過程中,除了需要調控區外,還需要反式作用因子。根據不同功能,常將反式作用因子分為以下三類:具有識別啟動子元件功能的基本轉錄因子;能識別增強子或沈默子的轉錄調節因子以及不需要通過DNA-蛋白質相互作用就參與轉錄調控的***調節因子。
實驗中,常將前兩類反式作用因子統稱為轉錄因子(transcription factor, TF),包括轉錄激活因子(transcriptional activator)和轉錄阻遏因子(transcriptional repressor)。這類調節蛋白能識別並結合轉錄起始位點的上遊序列或遠端增強子元件,通過DNA-蛋白質相互作用而調節轉錄活性,並決定不同基因的時間,空間特異性表達。
***調節因子本身無DNA結合活性,主要通過蛋白質-蛋白質相互作用影響轉錄因子的分子構象,從而調節轉錄活性。實驗中常將與轉錄激活因子有協同作用的那壹類***調節因子稱為***激活因子,
所有***激活因子都能識別靶位點(啟動子,增強子),而靶位點的特異性則由DNA結合域的特定序列決定。DNA結合域結合在特定的序列上,從而將激活因子上的轉錄激活域帶到基礎轉錄區域附近。
在植物學相關領域,科研工作者利用相關原理構建出誘導型的含有標簽的轉化載體,首先,設計特殊的啟動子,保證融合的轉錄因子(包括DNA結合域,轉錄激活域和受體調控域)組成型表達。壹旦實驗中加入化學小分子,該小分子與受體調控結構域相結合,導致融合表達的轉錄因子構象發生變化,由細胞質基質轉移入核內。融合蛋白就能特異性識別相關的DNA結合域並與之結合,該蛋白的轉錄激活域就能激活相關基因高水平表達。(簡單來說吧,就是壹個轉錄因子,它有三個域:1,結合DNA的,2,結合RNA聚合酶的,3,結合調節壹些化學調控因子的。加入某些化學小分子後轉錄因子被激活,進而激活基因表達。)
轉錄因子:識別TATA區的TF Ⅱ D,識別CAAT區的CTF,識別GGGCGG的SP1以及識別熱激蛋白啟動區的HSF。已知每個細胞中可含有約60 000個SP1,而CTF的含量則高達每個細胞300 000個。
反式作用因子是能直接或間接地識別或結合在各類順式作用元件核心序列上,參與調控靶基因轉錄效率的蛋白質。常見的DNA結合域包括堿性氨基酸結合域,酸性激活域,谷氨酰胺(Q)富含域,脯氨酸(P)富含域等。通常情況下,配體調節受體大多有DNA結合域和轉錄激活域。而甾醇類受體通常都是轉錄因子,其N末端都有保守的DNA結合域,C末端都有激素結合域。
1,螺旋-轉折-螺旋(helix-turn-helix,HTH)結構(這個結構是要去結合DNA的) 這壹類蛋白質分子中有至少兩個α螺旋,中間由短側鏈氨基酸殘基形成"轉折",近羧基端的α螺旋中氨基酸殘基的替換會影響該蛋白在DNA雙螺旋大溝中的結合。控制酵母交配型MAT基因座以及果蠅體節發育的調節基因(antp,ftz,ubx)等同源盒(homeobox)基因所編碼的蛋白都有HTH結構。與DNA相互作用時,同源域蛋白的第壹,二兩個螺旋往往靠在外側,其第三個螺旋則與DNA大溝相結合,並通過其N端的多余臂與DNA的小溝相結合。
同源域是指編碼60個保守氨基酸序列的DNA片段,它廣泛存在於真核生物基因組內,由於最早從果蠅 homeotic loci(該遺傳位點的基因產物決定了軀體發育)中克隆得到而命名,同源轉換基因與生物有機體的生長,發育和分化密切相關。許多含有同源轉換區的基因具有轉錄調控功能,同源轉換區氨基酸序列很可能參與形成DNA結合區。如下總結了部分含同源轉換區轉錄因子所識別的DNA序列,Oct-1,Oct-2,與Pit-1/GHF-1所識別的核心序列僅有壹個堿基之差,而果蠅en,ftz和ubx基因產物能識別完全相同的DNA序列。eve基因產物除識別與前者相同的序列外,還識別另壹個靶序列。
Oct-1 和 Oct-2專壹結合於啟動子內8堿基區,它們都含有75個氨基酸的pou區和60個氨基酸的同源轉換區。盡管Oct-1和Oct-2 中的同源盒與經典的果蠅同源轉換區變異較大(60個氨基酸中只有20個相同,外加8個保守性替換),該區在這兩個蛋白質中卻是高度保守的(60個氨基酸中有53個相同)。
2,鋅指(zinc finger)結構? 鋅指結構家族蛋白大體可分為鋅指,鋅鈕(twist),鋅簇(cluster)結構,其特有的半胱氨酸和組氨酸殘基之間氨基酸殘基數基本恒定,有鋅參與時才具備轉錄調控活性。重復的鋅指結構都是將壹個α螺旋與壹個反向平行β片層的基部以鋅原子為中心,通過與壹對半胱氨酸和壹對組氨酸之間形成配位鍵相連接,鋅指環上突出的賴氨酸,精氨酸參與DNA的結合。
鋅指結構中每壹個α螺旋可以特異的識別3~4個堿基。利用不同的鋅指結構識別特異DNA序列的特點以及核酸酶能夠切斷靶DNA的原理,科研工作者獲得了壹類被稱為鋅指核酸酶(zinc-finger nuclease,ZFN)的新型限制性內切核酸酶。根據改變鋅指結構通用序列中7個 X序列就能識別不同的DNA序列這壹特征,人工設計識別特異DNA序列的α螺旋,用TGEK作為螺旋間的連接序列,構建成對人工鋅指結構域和Fok I 融合蛋白(ZFN),就能在指定區域切斷DNA雙鏈。
3,堿性亮氨酸拉鏈(basic-leucine zipper),即bZIP結構。肝,小腸上皮,脂肪細胞以及某些腦細胞中存在的壹大類C/EBP家族蛋白,它們的特征是能夠與CCAAT區和病毒的增強子結合。C/EBP家族蛋白的羧基端35個氨基酸殘基具有能形成α螺旋的特點,其中每隔6個氨基酸就有壹個亮氨酸殘基,這就導致第7個亮氨酸殘基都在螺旋的同壹方向出現。
4,堿性-螺旋-環-螺旋(basic-helix/loop/helix),即bHLH結構 在免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強子結合蛋白E12與E47中,羧基端100~288個氨基酸殘基可形成兩個雙性α螺旋,被非螺旋的環狀結構所隔開,
轉錄活化結構域
在真核生物中。反式作用因子的功能由於受蛋白質-蛋白質之間相互作用的調節變得精密復雜,完整的轉錄調控功能通常以復合物的方式來完成,這就意味著並非每個轉錄因子都直接與DNA結合。因此,是否具有轉錄活化域就成為反式作用因子中唯壹的結構基礎。反式作用因子的功能具有多樣性,其轉錄活化域也有多種,通常依賴於DNA結合結構域以外的30~100個氨基酸殘基。不同的轉錄活化域大體上有下列幾個特征結構:
1,帶負電荷的螺旋結構
2,富含谷氨酰胺的結構
3,富含脯氨酸的結構
利用順式作用元件和反式作用因子間相互作用的原理,科研人員研發了許多調控基因表達的技術。其中最新的應用當屬TALEN技術(TALEN=transcription activator-like effector+FokI nuclease fusion protein),該技術利用轉錄激活因子34個氨基酸重復肽段中第12,13個氨基酸可以特異識別DNA方法堿基的特性,串聯合成可識別目的堿基序列的TALE蛋白,與內切核酸酶FokI融合表達,可切割特異識別序列下遊9~13bp,從而實現敲除指定內源基因的功能。
在真核生物中,發生在轉錄之前的,染色質水平上的結構調整,稱之為基因表達的表觀遺傳調控。主要包括DNA修飾(DNA甲基化)和組蛋白修飾(組蛋白乙酰化,甲基化)兩個方面。
分子生物學最新研究表明,在個體發育過程中,用來合成RNA的DNA模板也會發生規律性變化,從而調控基因表達和生物體的發育。
高度重復基因的形成通常與個體分化階段DNA的某些變化有關。例如,壹個成熟的紅細胞能產生大量的可翻譯出成熟珠蛋白的mRNA,而其前體細胞卻不產生珠蛋白。許多情況下,這種變化是由於基因本身或其拷貝數發生了永久性變化。這種DNA水平的調控是真核生物發育調控的壹種形式,包括基因丟失,擴增,重排和移位等方式,通過這些方式可以消除或變換某些基因並改變它們的活性。這些調控方式使基因組發生改變,與轉錄及翻譯水平的調控不同。
1,"開放"型活性染色質(active chromatin)結構對轉錄的影響 真核基因的活躍轉錄是在常染色質上進行的。轉錄發生之前,染色質常常會在特定區域被解旋松弛,形成自由DNA。這種變化可能包括核小體結構的消除或改變、DNA本身局部結構的變化甚至從右螺旋型變為左螺旋型(Z-DNA)等,這些變化可導致結構基因暴露,促進轉錄因子與啟動區DNA結合,誘發基因轉錄。。用DNA酶I處理各種組織的染色質時,發現處於活躍狀態狀態的DNA更容易被DNA酶I所降解。
研究發現,活躍表達的基因所在染色質上壹般含有壹個或數個DNA酶I超敏感位點(hypersensitive site),它們大多位於基因5'端啟動區,少數在其他位置。而非活性基因的5'端相應位點卻不表現對DNA酶I的超敏感性。有人用專壹切割單鏈DNA的SI核酸酶處理該基因活躍表達的染色體DNA,證實有DNA被水解,說明該基因活躍表達時啟動區部分序列可能解開成單鏈,從而不能繼續纏繞在核小體上,使啟動區DNA "裸露" 在組蛋白表面,形成對DNA酶I的超敏感現象。上述實時說明,超敏感位點的產生可能是染色質結構規律性變化的結果。正是由於這種變化,使DNA容易與RNA聚合酶和其他轉錄調控因子相結合,從而啟動基因表達,同時也更容易被核酸酶降解。
有證據表明,存在"燈刷形"染色體(lamp brush)上的環形結構可能與基因的活性轉錄有關。
2,基因擴增
基因擴增是指某些基因的拷貝數專壹性大量增加的現象,它使細胞在短期內產生大量的基因產物以滿足生長發育的需求,是基因活性調控的壹種方式。
3,基因重排與變換
將壹個基因從遠離啟動子的地方移到距離它很近的位點從而啟動轉錄,這種方式被稱為基因重排。。。或將幾個相距較遠的基因片段通過染色體內DNA重組把幾個相隔較遠的基因片段連接在壹起,從而產生具有表達活性的蛋白。
DNA甲基化是最早發現的修飾途徑之壹,這壹修飾途徑可能存在於所有高等生物中並與基因表達調控密切相關。大量研究表明,DMA甲基化能關閉某些基因活性,去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。DNA甲基化能引起染色質結構,DNA構象,DNA穩定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改變,從而調控基因表達。研究證實,CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化導致了人體1/3以上由於堿基轉換而引起的遺傳病。
1,DNA甲基化
DNA甲基化修飾現象廣泛存在於多種有機體中。在染色體水平上,DNA甲基化在著絲粒附近水平最高;在基因水平上,DNA甲基化高水平區域涵蓋了多數的轉座子,假基因和小RNA編碼區。甲基化似乎對於長度較短的基因有較強的轉錄調控能力,而對長基因的調控能力十分微弱。實驗證明,這個過程不但與DNA復制起始及錯誤修正時的定位有關,還通過改變基因的表達參與細胞的生長,發育過程及染色體印跡,X染色體失活等的調控。DNA甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)和少量的N6-甲基腺嘌呤(N6-mA,這裏6都是上標)及7-甲基鳥嘌呤(7-mG)。在真核生物中,5-甲基胞嘧啶主要出現在CpG序列CpXpG,CCA/TGG和GATC中。因為高等生物CpG二核苷酸序列中的C通常是甲基化的,極易自發脫氨,生成胸腺嘧啶,所以CpG二核苷酸序列出現的頻率遠遠低於按核苷酸組成計算得到的頻率。由於這些CpG二核苷酸通常成串出現在DNA上,這段序列往往被稱為CpG島。
真核生物細胞內存在兩種甲基化酶活性:壹種被稱為日常型甲基轉移酶,另壹種是從頭合成型甲基轉移酶,前者主要在家裏化母鏈(模板鏈)指導下使處於甲基化的DNA雙鏈分子上與甲基胞嘧啶相對應的胞嘧啶甲基化,該酶催化特異性極強,對半甲基化的DNA有較高的親和力,使新生的半甲基化DNA迅速甲基化,從而保證DNA復制及細胞分裂後甲基化模式不變。後者催化未甲基化的CpG成為mCpG,它不需要母鏈指導,但速度很慢。這類甲基化酶是導致特異基因受甲基化調控的主要因子,在基因表達的變觀遺傳學研究中有十分重要的地位。
2,DNA甲基化抑制基因轉錄的機理
DNA甲基化導致某些區域DNA構象變化,從而影響了蛋白質與DNA的相互作用,抑制了轉錄因子與啟動區DNA的結合效率。研究表明,當組蛋白H1與含CCGG序列的甲基化或非甲基化DNA分別形成復合體時,DNA的構型存在很大的差別,甲基化達到壹定程度時會發生從常規的B-DNA向Z-DNA的過渡。由於Z-DNA結構收縮,螺旋加深,許多蛋白質因子賴以結合的元件縮入大溝而不利於基因轉錄的起始。人們用序列相同但甲基化水平不同的DNA為材料,比較其作為RNA聚合酶轉錄模板的活性,發現甲基的引入不利於模板與RNA聚合酶的結合,從而降低其體外轉錄活性。
5-甲基胞嘧啶在DNA上並非隨機分布,基因的5'端和3'端往往富含甲基化位點,而啟動區DNA分子上的甲基化密度與基因轉錄受抑制的程度密切相關。對於弱啟動子來說稀少的甲基化就能使其完全失去轉錄活性。當這壹類啟動子被增強時(帶有增強子),即使不去甲基化也可以恢復其轉錄活性。若進壹步提高甲基化密度,即使增強後的啟動子仍無轉錄活性。因為甲基化對轉錄的抑制強度與MeCP1(methyl CpG-binding protein 1)結合DNA的能力成正相關,甲基化CpG的密度和啟動子強度之間的平衡決定了該啟動子是否具有轉錄活性。
DNA甲基化還提高了該位點的突變頻率。
3,DNA甲基化與X染色體失活
X染色體失活是發育過程中獨特的調節機制。雌性胎生哺乳動物中兩條X染色體之壹在發育早期隨機失活,以確保與只有壹條X染色體的雄性個體內X染色體基因的劑量相同。
組蛋白乙酰化對基因表達的影響:
1,組蛋白的基本組成:組蛋白(histone)是組成核小體的基本成分,核小體(nucleosome)是組成染色質的基本結構單元。核小體由組蛋白八聚體(由兩個包含H2A,H2B,H3,H4的四聚體組成)和纏繞兩圈的DNA組成。在相鄰的核小體之間有壹個20~200bp的間隔區,在電子顯微鏡下,壹列核小體看上去像壹串珠子,每個珠子的直徑大約是10nm。另壹個組蛋白H1結合在核小體核心之外,起到穩定核小體序列和染色質的高級結構的作用。
2,核心組蛋白的乙酰化和去乙酰化
核心組蛋白朝向外部的N端部分被稱為"尾巴",可被組蛋白乙酰轉移酶和去乙酰轉移酶修飾,加上或去掉乙酰集團。如下圖是已報道的組蛋白N端"尾巴"主要被修飾位點。
3,組蛋白乙酰基轉移酶
催化組蛋白乙酰化反應的組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferase,HAT)。目前已發現的HAT主要有兩類:壹類與轉錄有關,另壹類與核小體組裝以及染色質的結構有關。HAT並不是染色質結合蛋白,但是可以通過與其他蛋白相互作用來影響染色質的結構。許多轉錄激活因子都有HAT活性,與轉錄有關的HAT催化亞基是酵母調控蛋白質GCN5的同源物,而GCN5本身具有乙酰化組蛋白H3和H4的活性。
TAF Ⅱ 250組蛋白乙酰轉移酶是TF Ⅱ D 復合物的壹個亞基它的主要功能是與啟動子結合協助起始轉錄,能使組蛋白H3和H4乙酰化。轉錄***激活子PCAF也能使這兩個組蛋白乙酰化。組蛋白乙酰轉移酶p300/CBP也是轉錄***激活子,通過與增強子結合蛋白相互作用來調節轉錄,能使組蛋白H2A,H2B,H3,H4乙酰化。與激素受體協同作用的轉錄***激活子ACTR也是壹種作用於H3和H4的組蛋白乙酰轉移酶。
4,組蛋白去乙酰化
組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)負責去除組蛋白上的乙酰基團,目前研究比較深入的是人類中的HDAC1和酵母中的Rpd3。HDAC和Rpd3都形成很大的蛋白復合體發揮作用。Rpd3能特異性去除組蛋白上的乙酰基團,使核小體相互靠近,並在轉錄***抑制子Sin3及R的協同作用下,抑制基因轉錄。
5,組蛋白乙酰化及去乙酰化對基因表達的影響
組蛋白乙酰轉移酶和去乙酰化酶通過使組蛋白乙酰化和去乙酰化對基因表達產生影響。組蛋白N端"尾巴"上賴氨酸殘基的乙酰化中和了組蛋白尾巴的正電荷,降低了它與DNA的親和性,導致核小體構象發生有利於轉錄調節蛋白與染色質相結合的變化,從而提高了基因轉錄的活性。
組蛋白甲基化對於真核基因表達的調控
基因沈默(又稱RNA沈默,RNA silencing)是指真核生物中由雙鏈RNA誘導的識別和清除細胞中非正常RNA的壹種機制。通常情況下基因沈默可以分為轉錄水平基因沈默(transcriptional gene silencing)和轉錄後水平基因沈默(post-trancriptional gene silencing)
RNA幹擾(RNA interference, RNAi)是指由雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)誘發的同源mRNA高效特異性降解的技術。由於RNAi技術可以特異性降低或關閉目的基因表達,該技術已被廣泛用於探索基因功能和疾病的基因治療領域。
1,幹擾小RNA(small interfering RNA,siRNA):
實驗表明,雙鏈RNA對內源基因表達的幹擾效率遠高於單鏈的RNA,真正起到RNA沈默作用的應該是雙鏈RNA。此外,研究還發現,引入的外源RNA只對同源基因有高沈默效率,暗示它們之間可能需要形成配對的基礎。2000年,RNAi研究有了重要進展,揭示了dsRNA介導的RNAi現象的許多重要特性。研究者開發了壹套基於果蠅細胞提取物的體外RNAi研究系統,發現無論是否有靶mRNA的存在,引入的外源dsRNA的正義,反義鏈都會被切割成21~23nt的小片段,相對應的靶mRNA也會被降解成長度差為21~23nt的片段,說明這種降解很可能是由21~23nt小片段介導的,並且這種降解需要ATP提供能量。現在,已統壹將介導這種沈默現象的小片段RNA稱為幹擾小RNA(small interfering RNA,siRNA)。
2,siRNA的生物合成
病毒RNA以及由環境,實驗因素引入的外源RNA都可能是siRNA的來源。此外,基因組重復片段,轉座子等序列也可能產生siRNA。通常壹個長為21nt的雙鏈小RNA,其中19nt形成配對雙鏈,3'端各有兩個不配對核苷酸序列而5'端為磷酸基團。其中壹條鏈為引導鏈(guide strand),介導mRNA的降解;另壹條鏈為乘客鏈(passenger strand),在siRNA形成有功能的復合物前被降解。
siRNA的產生過程主要包括著3個核心步驟:1,經Dicer切割形成雙鏈小片段;
2,組裝復合物;
3,形成有活性的沈默復合物(RNA induced silencing complex,RISC)
(1)Dicer切割? Dicer是壹類RNase Ⅲ 蛋白,主要包括壹對RNase Ⅲ 結構域,雙鏈RNA結合域,解旋酶結構域和PAZ結構域。PAZ結構域可以結合雙鏈RNA的兩個3'不配對核苷酸。兩個RNase Ⅲ 結構域形成分子內二聚體結構,各催化剪切壹條鏈,產生雙鏈斷裂。結構生物學研究表明,PAZ結構域和 RNase Ⅲ 催化切點約相距6.5nm,與20多個核苷酸的長度相當,因此,Dicer本身可以作為壹把裁剪的尺子,用來切出長為21~23nt的siRNA。
(2)R2D2的裝配? siRNA的裝載需要雙鏈RNA結合蛋白R2D2的幫助。R2D2包含兩個壹前壹後的雙鏈RNA結合結構域,有報道認為R2D2可以結合雙鏈小RNA熱穩定性較高的壹端。
(3) RISC的裝配和成熟?
。。。
miRNA
真核基因其他水平上的表達調控
蛋白質磷酸化對基因轉錄的調控