MSK-IMPACT (Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets) 是美國紀念斯隆卡特琳癌癥中心（MSK）的壹款 NGS 大panel 產品，自2014年1月起被 MSK 用於制定晚期癌癥患者的治療方案。該Panel 壹直進行叠代升級，涵蓋基因數量也壹直在增長，由2014年的341個基因，到2017年的468個基因，之後又增加了新的腫瘤驅動基因、與免疫治療及克隆性相關的基因到2020年的已包括505個基因。MSK-IMPACT?於2017年11月16日通過FDA批準，成為第壹款通過審批檢測組織多癌種多基因的大Panel 產品。
MSK-IMPACT 通過對腫瘤組織 FFPE 樣本和 Normal 樣本進行 Panel 捕獲、NGS測序及生信分析檢測，可以廣泛檢測基因組中的腫瘤基因突變。它采用的測序平臺是Illumina HiSeq? 2500 Sequencer (qualified by MSK)，檢測的突變類型有 SNVs、INDEL（<30bp）、MSI，不能檢測CNVs、重排和TMB 。本篇文章主要對通過FDA審批 468 個基因版本的MSK-IMPACT 技術細節進行匯總介紹。
附表Appendix 1a 列出了MSK-IMPACT的檢測熱點，附表Appendix 1b 列出了468個基因和相應的轉錄本信息，附表Appendix 1c 列出了73個Panel 覆蓋深度低，不進行報出的基因和外顯子區域信息。
質控要求腫瘤細胞含量大於10%，切片含量大於20%，MSI檢測腫瘤細胞含量大於25%
略
利用純合位點壹致性對來自同壹樣本的Normal樣品和Tumor樣品的配對情況進行檢測，可以預期配對樣品純合位點不壹致性較低（<5%）,不配對樣品純合位點不壹致性較高（在25%附近）。如果配對樣品純和位點不壹致水平較高（>5%）,則被標記為“可能不配對”類型。
檢測雜合位點不同等位基因的頻率，如果頻率異常，對樣品進行標記為“可能汙染”類型。
Normal樣品中不應該含有SNVs、INDEL。分析流程會對Normal樣品中的變異熱點進行檢測，如果有熱點的變異頻率>1%,對樣品進行標記
SNVs( MuTect 軟件) 和 INDELs( SomaticIndelDetector 軟件) CALL變異流程需要 Normal 和 Tumor 配對樣品，如果缺少Normal樣品或者Normal樣品的平均測序深度較低（<50X）, 則從批處理樣品中選擇壹個Normal樣品作為對照。
對NC樣品分析用於確定沒有汙染以及對PC樣品分析用於保證分析的靈敏度
Tumor 樣品質控要求 98% 的外顯子覆蓋深度大於200X，配對Normal樣品深度大於50X
原始SNV 和INDEL 突變需要經過下面壹系列的過濾來保證報出突變的準確性。
（1） VFtumor/VFnormal >=5，AD>=5,VF>=1%
（2） 突變是否在熱點突變庫中，Appendix 1a 為熱點列表
（3） 熱點： DP>=20,AD>=8,VF>=2%;非熱點：DP>=20,AD>=10,VF>=5%
（4） 過濾註釋結果，保留位於外顯子區域的非同義突變，移碼突變
利用 MSIsensor 軟件計算 MSK-IMPACT 覆蓋的所有MSI位點的狀態。MSIsensor會計算出壹個score,如果閾值大於10，標記為MSI-H。
病人組織或者外周血作為Normal樣品，如果使用分批中不配對的Normal樣品，可能會有壹些稀有的胚系突變被當做體細胞突變
陽性對照是3個陽性樣品（3個樣品各自含有不同的類型和頻率的突變信息）的混合，陽性對照的normal樣品是統壹批次Normal樣品的混合，經過流程分析後，檢驗分析的結果。（1）已知的突變是否檢出（2）檢出的突變頻率和原始樣品的突變頻率是否壹致，Table2是已知的突變頻率的樣本。
陰性控制樣本是以前的重復試驗證實的沒有腫瘤汙染和沒有胚系拷貝數突變的FFPE正常樣品的混合物。以前的分析已經確定了正常樣品特有多態性和頻率，將流程產生的862個SNP的突變頻率和預期的突變頻率進行比較，計算Pearson壹致性。預期突變頻率應該大於0.9
No Template Control(NTC)
樣品質量控制度量：
這裏計算所需要的覆蓋深度都用到了功效分析（power analysis）的概念
1a 外顯子覆蓋深度的確定：
當設定潛在最低檢測線如2%時，可以通過功效分析可以計算出某顯著水平下的reads的深度。比如當突變頻率為10%時，500X深度95%置信區間下，突變頻率的範圍在7.5%和13%之間。
所以，將10個不相關的FFPE的Normal樣本等摩爾的混合創造了壹系列預設的突變頻率，最低的突變頻率為5%。然後用862個SNPs驗證了預設的突變頻率和真實突變頻率之間的關系。最後試驗數據支持使用5%作為報告檢測到的突變的下限，實際潛在的頻率為10%。
Run內和Run間設置重復，每個樣品5個重復
1a Panel 精密度驗證（標準品的驗證）
10個樣本（9個FFPE樣本，壹個商業細胞系）代表不同的腫瘤類型，不同的突變類型（突變類型已知），不同的突變頻率（突變頻率已知）。
2b Panel精密度和重復性壹致性驗證（標準品的驗證）
Table6在對已知的突變進行精密度評估時，也對重復樣品檢出的已知突變外的其他突變進行了重復壹致性的驗證。
5個重復樣本檢出的所有突變數目的壹致性
5個樣品檢出的突變頻率的壹致性
Table7列出了10個測試樣本（每個樣本5次重復）精密度驗證的結果
LoD是某壹種突變在所有的重復中，95%的重復都可以穩定的檢測出的突變等位基因頻率。 本部分就是驗證假定突變的LoD。測試分為兩個部分。第壹部分是梯度稀釋，確定可靠的最低突變頻率；第二部分是在眾多重復中，驗證LoD.
1a 梯度稀釋
選擇10個FFPE樣本，各選擇5個覆蓋度最高的外顯子和覆蓋度最低的外顯子。制備5-8個梯度稀釋
檢出結果 Table10
1a SNV/indel 變異方法的比較
MSK-IMPACT方法與MSK-IMPACT方法正交驗證後的原始結果進行了比較。***檢測了433個FFPE樣本的20個基因的48個外顯子，檢出267個唯壹的突變位點。433個樣品中的已知突變***432個樣品檢測出，壹個樣品的EGFR基因的INSERT漏檢。
檢出的壹致性Table15A-C.
最終的MSK報告的突變分為兩種：壹種是具有臨床意義的癌癥突變，壹種是具有潛在意義的癌癥突變。
1a 臨床樣本的驗證
MSK測試了超過壹萬例的晚期腫瘤患者，並將病歷信息以及突變信息存儲在了下列網站。
https://www.cbioportal.org/study/summary?id=msk_impact_2017
https://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/reviews/DEN170058.pdf