測序是混合樣品測序，如何把這些不同樣品進行分離？人們想到了壹種在文庫構建時在接頭上添加“接頭暗號”的方法，在測序完成之後根據“接頭暗號”對樣本進行分離。這裏的接頭暗號就是樣本標簽“ Index/Barcode ”。
接頭的本質是壹段短的堿基序列，基本包括 三個 部分：與flow-cell上面寡核苷酸相同或互補的片段 P5/P7 ；測序時測序引物結合部分 R1/R2 ；用於區分不同樣本的 Index/Barcode 。 接頭是待測DNA片段與Flow-cell連接的橋梁 ，目的片段連接接頭後可以在flow cell上擴增再測序。
接頭的分類方法主要有兩種，壹是按照Index的位置，二是按照是否匹配PCR free建庫。
（1）根據Index位置可以將接頭分為 單端Index接頭 和 雙端Index接頭 。單端Index接頭指的是僅在P5端或P7端存在Index（壹般在P7端），雙端Index接頭指的在P5和P7端均存在Index。（ 如圖2所示 ）。Index的數目直接影響最終上機能混合的樣本數目，雙端Index具有比單端Index能容納更多數目的樣本，近年來為了滿足壹次能測量更多的樣本的需求， 雙端帶Index的接頭被廣泛使用 。
圖2：接頭按照Index位置分為單端Index接頭和雙端Index接頭，兩種接頭連接後示意圖
（2）根據接頭是否匹配PCR free建庫可以將接頭分為長接頭和短接頭（見圖3）。長接頭又稱為完整接頭，包括P5/P7+Index序列+Read 1/2，完整接頭通過TA克隆的方式連接到DNA片段之後，可不進行PCR擴增反應直接上機測序（DNA量足夠上機測序時可直接上機，當DNA量不夠時還需進行PCR擴增使得產物達到壹定的量方可上機測序）。短接頭通過TA克隆方式連接到DNA片段上後，必須與短接頭互補的引物進行PCR擴增，擴增產物就是包含完整接頭的DNA片段（見圖4）。也就是說短接頭最終壹定要通過PCR擴增成為完整接頭才能上機測序。
Index作為接頭中的重要組成部分到底有著怎樣的奧秘呢？簡單來說Index就是混合樣本中不同樣本的“身份證”，其本身就是壹段堿基序列，壹般長6nt或8nt。通過對這種“身份證”的識別，就可以在混合樣本中對單個樣本的數據進行識別。那麽問題來了，四種堿基隨機構成的排列組合序列那麽多，這些都可以用作Index嗎？選擇Index序列的依據又是什麽呢？
Index的選擇需滿足兩個原則：堿基平衡和激光平衡
a）堿基平衡：是指Index序列的復雜度和平衡度：復雜度指的是堿基的種類的多樣；平衡度指的是堿基之間分布比例的均衡。需要註意的是堿基的平衡是指多個Index之間的平衡，而不是單個index內部的堿基平衡。最好的Index序列應該是均含有A、T、C、G四種堿基，且各堿基之間的比例接近25%，如圖5所示。
b） 激光平衡(必須考慮) ：是指在壹組Index序列中需滿足每個堿基位A + C =G + T，在Illumina測序儀中，A和C兩種堿基***用壹種激光，由波長660nm的紅激光激發；G和T***用壹種激光，由波長532 nm的綠激光激發。需要說明的是激光平衡是在堿基不平衡的情況下的無奈之舉，在壹定程度上可以提高index測序時的堿基識別質量，減少數據分離時出問題的可能性，見圖6。 如樣本數為單數，則必然無法滿足堿基平衡和激光平衡，此時可以選擇幾個縱列是完全互補的兩個Index，再加上壹個其他的Index，可最大程度保證測序質量。
轉自： 壹文全面解析NGS接頭的奧秘 - 商家動態 - 資訊 - 生物在線 (bioon.com.cn)