分析了近年來國內幾種常見的物理和化學誘變育種方法的原理、特點和成功案例，為微生物誘變育種提供了依據。綜述了信息技術在酶制劑、抗生素、氨基酸、維生素和農藥等高產菌株選育中的應用進展。展望了該技術結合離子束技術和空間技術在微生物菌種選育中的應用前景。
關鍵詞:突變；微生物繁殖；申請進度；前景
微生物與釀酒工業、食品工業、生物制品工業等密切相關。它們的菌種質量直接關系到許多工業產品的質量，甚至影響到人們的日常生活質量，因此需要培育優質高產的微生物菌種。微生物育種的目的是引導生物合成的代謝途徑向所需方向發展，或促進細胞內基因的重組以優化遺傳性狀，人為積累壹些代謝產物，以獲得高產、優質、低耗的所需菌株。誘變育種作為其中壹種方法，已被廣泛應用。目前，國內微生物育種界仍主要采用常規理化因子等誘變方法。此外，原生質體誘變技術已廣泛應用於酶制劑、抗生素、氨基酸、維生素等菌種的選育，並取得了許多重大成果。
1，誘變育種
1.1物理突變
1.1.1紫外線照射
紫外線照射是壹種常用的物理誘變方法，也是誘導微生物突變的壹種非常有用的工具。DNA和RNA中嘌呤和嘧啶的最大吸收峰在260nm，因此260nm的紫外線是最有效的致死劑。紫外線的作用有很多解釋，但確定的作用是使DNA分子形成嘧啶二聚體[1]。二聚體的形成會阻礙堿基之間的正常配對，因此可能導致突變甚至死亡[2]。
紫外輻照誘變簡單經濟，在壹般實驗室條件下即可實現，正突變概率高。這種方法主要用於酵母菌株的誘變。
1.1.2電離輻射
γ射線是電離生物學中應用最廣泛的電離射線之壹。它能量高，能產生電離，電離能直接或間接改變DNA的結構。直接影響就是脫氧核糖的堿基可以被氧化，或者脫氧核糖的化學鍵和糖與磷酸的化學鍵。其間接作用是水或有機分子能產生自由基，自由基能與細胞內溶質分子發生化學變化，導致DNA缺失和損傷[2]。
除了γ射線，電離輻射還包括X射線、β射線和快中子。電離輻射有壹定的局限性，操作要求高，有壹定的危險性，通常用於其他誘變劑不能使用的誘變育種過程。
1.1.3離子註入
離子註入是80年代初出現的高新技術。主要用於金屬材料的表面改性。從1986開始逐漸用於作物育種，近年來逐漸引入微生物育種[3]。
在離子註入過程中，生物分子吸收能量並引起復雜的物理和化學變化。這些變化的中間產物是各種活性自由基。這些自由基會對其他正常生物分子造成損害，破壞細胞中的染色體突變和DNA鏈，還會破壞質粒DNA。由於離子註入範圍可控，隨著微束技術和精確定位技術的發展，定位誘變將成為可能[4]。
用於微生物誘變育種的離子註入在壹般實驗室條件下難以實現，目前應用相對較少。
1.1.4激光
激光是壹種光量子流，也稱為光學粒子。激光輻射可以通過光、熱、壓力和電磁場效應的綜合應用，直接或間接地影響生物體，引起染色體畸變效應、酶的激活或失活、細胞分裂和細胞代謝活動的變化。光量子壹旦作用於細胞內含物中的任何物質，都可能導致生物有機體的細胞學和遺傳學特征的變異。不同種類的激光照射生物有機體表現出不同的細胞學和遺傳學變化[5]。
激光作為壹種育種方法，具有操作簡單、使用安全等優點，近年來在微生物育種方面取得了很多進展。
1.1.5微波
微波輻射是壹種低能電磁輻射，在300MHz~300GHz的頻率範圍內具有很強的生物效應，對生物體有熱效應和非熱效應。它的熱效應意味著它可以導致生物的局部溫度升高。從而引起生理和生化反應；非熱效應是指微波作用下與溫度無關的各種生理生化反應。在這兩種效應的共同作用下，生物會產生壹系列的突變效應[6]。
因此，微波也被用於農作物育種、動物育種和工業微生物育種等多個領域的誘變育種，並取得了壹定的成果。
1.1.6太空育種
太空育種又稱太空誘變育種，是利用高空氣球、返回式衛星、飛船等航天器將農作物種子、組織、器官或生命個體搭載到太空，利用太空的特殊環境使生物基因發生變異，然後返回地面進行育種、培育新品種、新材料的壹種農作物育種新技術。空間環境因素主要包括微重力、空間輻射以及交變磁場、超真空環境等其他誘變因素。這些因素的相互作用導致生物系統中遺傳物質的損傷，從而導致突變、染色體畸變、細胞失活、發育異常等生物學現象的發生。
與其他育種方法相比，航天育種是航天技術與微生物育種技術的有機結合，技術含量高、成本高，是單個科研人員或壹般科研單位難以實現的。只能結合航天技術，由國家完成。
2.1化學突變
2.1.1烷化劑
烷化劑可以與壹個或幾個核酸堿基反應，導致DNA復制和遺傳變異過程中堿基配對的轉變。常用的烷化劑有甲基磺酸乙酯、亞硝基胍、乙烯亞胺、硫酸二乙酯等。
甲基磺酸乙酯(EMS)是最常用的烷化劑，其致突變率很高。其誘發的突變多為點突變，具有很強的致癌性和揮發性，5%的硫代硫酸鈉可作為終止劑和解毒劑。
N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(NTG)是壹種超誘變劑，應用廣泛，但有壹定毒性，操作時應註意。在堿性條件下，NTG會形成重氮甲烷(CH2N2)，這是導致死亡和突變的主要原因。其作用可能是由DNA與CH2N2的烷基化作用引起的[2]。
硫酸二乙酯(DMS)也是常用的，但由於毒性很強，目前很少使用。乙烯亞胺，產量少，很難買到。使用濃度為0.0001%~0.1%，具有高度致癌性，需配緩沖液。
2.1.2堿基類似物
堿基類似物的分子結構與天然堿基相似，可以整合到DNA分子中，導致DNA復制過程中的錯配、mRNA轉錄紊亂、功能蛋白重組和表型改變。這些物質毒性相對較小，但負突變率較高，往往很難得到好的突變體。主要有5-氟尿嘧啶(5- FU)、5-溴尿嘧啶(5- BU)和6-氯嘌呤。程等[25]用5- BU對產色素細菌(分枝桿菌T17- 2- 39)的細胞進行誘變，平均生物量增加了22.5%。
2.1.3無機化合物
致突變作用壹般，危險性小。常用氯化鋰，白色結晶，使用時配制成0.1%~0.5%溶液，也可直接加入誘變固體培養基中30 min ~ 2天。亞硝酸鹽容易分解，所以現在用。常用亞硝酸鈉和鹽酸制備亞硝酸鈉，亞硝酸鈉的濃度為0.01~0.1mol/L，使用時可加入相同濃度和體積的鹽酸。
2.1.4其他
還原劑鹽酸羥胺作用於C使G- C變為A-T，也是常用的，濃度為0.1% ~ 0.5%，作用時間為60 min ~ 2 h。
另外，誘變時，兩種或兩種以上誘變因子聯合使用，或同壹誘變因子反復使用，效果更佳。顧等[7]以谷氨酸棒桿菌- 13761為出發菌株，經DMS和反復誘變，獲得壹株產L-組氨酸菌株。
2、誘變劑
2.1突變體選擇
在選擇誘變劑時，需要註意誘變劑的特異性，即壹種誘變劑或突變處理優先使基因組的某些部分發生突變，而其他部分很少發生突變，如果有的話。雖然誘變劑特異性的分子基礎還不太清楚，雖然相關的修復途徑肯定對其有影響，但它們之間的關系並不是那麽簡單，其他因素，包括誘變處理的環境條件，也會影響突變類型。
工業遺傳學家很難正確預測改良某個菌株需要什麽樣的分子突變。因此，為了產生盡可能多類型的突變體，最合適的方法是采用幾種互補類型的突變處理。遠紫外線無疑是最合適的誘變劑，它似乎能誘發所有已知的損傷類型。也很容易采取有效安全的預防措施。在化學誘變劑中，液體試劑比粉末試劑更容易安全操作。另壹個缺點是，它傾向於產生緊密相連的突變簇，盡管這種效應在壹些系統中可能是有利的條件。最後，必須認識到某些特定的菌株可能不會被某些誘變劑誘變。當然，這可以很容易地通過測量容易檢測的突變體，如抗藥性突變體或原營養回復體的突變動力學來驗證。[8]
2.2誘變劑的劑量
從隨機篩選的最佳效果來看，誘變劑的最佳劑量是在用於篩選的存活群體中獲得所需突變體的比例最高，因為這樣會使其在效價測定階段更加省力。
因此，在菌株改良前，為了確定誘變劑的最佳劑量，為誘變增強技術奠定基礎，通常明智的做法是在處理不同菌株時，確定不同誘變劑的誘變動力學。高單位突變本身有時無法確定最佳劑量，因為很難檢測到這種突變。但如果使用耐藥標誌物等易於檢測的標誌物，只要估計方法的局限性，還是可以提供壹些有價值的信息。[9]
3.原生質體誘變在工業微生物育種中的應用進展。
3.1在酶制劑菌株選育中的應用
酶制劑是生物機體產生的催化蛋白，是所有代謝過程中的必需元素。利用原生質體誘變技術對酶制劑生產菌株進行誘變，獲得了許多高產菌株。
胡潔等人[10]進行了紫外-氯化鋰，N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(N-method-N′-硝基-N-硝基胍，Nt。篩選出8株高產中性蛋白酶的突變菌株，最高產酶量是出發菌株的1162倍，為今後的細胞融合和基因組重組提供了優良的候選文庫。
3.2抗生素生產菌株選育的應用
抗生素是微生物細胞的次級代謝產物。目前，微生物發酵主要用於生物合成。由於生產菌株的產量受到多步代謝調控的制約，也很難選育出高產菌株。原生質體誘變作為壹種誘變技術，已廣泛應用於抗生素高產菌株的選育。
朱等[11]對釀酒鏈黴菌原生質體進行紫外線誘變，獲得壹株普那黴素產量為1159g/L的高產突變株，比出發菌株提高了10165438。
3.3在氨基酸、生產溶劑和有機酸育種中的應用
氨基酸是蛋白質的基本單位，蛋白質是壹種生物功能高分子。廣泛應用於食品、飼料、醫藥、化工、農業等行業，各國都在大力發展氨基酸生產。發酵已成為氨基酸生產的主要方法。因此，選育高產菌株是氨基酸工業發展的重要方向。
生產溶劑和有機酸是微生物的初級代謝產物，原生質體誘變技術在生產溶劑和有機酸產生菌的選育方面也取得了成果。
3.4生物源菌種選育的應用
維生素是壹類維持人類和動物生命活動所必需的，但自身不能合成的有機物質，在生長、代謝和發育過程中起著重要的作用。韓等對青黴PT95原生質體進行激光處理，選育出壹株菌核生物量和類胡蘿蔔素含量顯著提高的突變菌株L05。突變體菌核產量提高了98.6%，菌核中類胡蘿蔔素含量提高了28.3%，類胡蘿蔔素產量提高幅度達到154.0%。
3.5昆蟲育種的應用
蘇雲金芽孢桿菌是壹種從自然界篩選出來的細菌微生物殺蟲劑，主要用於防治農林害蟲。王力宏等[12]采用UV-LiCl復合誘變方法對蘇雲金芽孢桿菌NU- 2原生質體進行誘變，篩選出的突變體發酵周期由44h縮短到40.3h，晶體蛋白含量提高了10.03%。
4.放眼未來
近年來，隨著新的誘變源的出現，原生質體誘變技術的應用也將取得新的進展。離子束作為壹種新的誘變源，有其獨特的作用機理[13]，使得離子束誘變具有誘變譜廣、變異範圍大、誘變率高等優點。它的應用也取得了許多重要成果，特別是離子註入選育VC菌株的成功，為我國Vc產業增添了活力。太空中攜帶的微生物菌種，通過微重力、空間輻射、超真空等綜合空間環境因素的改造，可以在短時間內產生罕見的基因突變，從而進行微生物育種，是空間技術育種的重要應用領域。利用空間技術提高某些抗生素的產量和研究酶制劑已有壹些可喜的成果。結合離子註入、空間技術和微生物原生質體技術，微生物原生質體誘變技術將有更廣闊的應用前景。
5.結論
隨著遺傳學和分子生物學的快速發展，許多新的復雜技術被應用於菌株育種，如原生質體融合育種技術和基因工程育種技術，但誘變育種技術仍然是提高菌株生產力的重要而有效的手段。它的正突變率比較高，可以獲得許多優良的突變體和新的有益基因類型。另壹方面，誘變育種具有壹定的盲目性和隨意性。在實際應用中，研究人員應根據出發菌株和實驗室條件等具體情況選擇合適的誘變方法。本實驗室采用物理因子和化學因子相結合的方法對多種酵母菌株進行復合誘變，均獲得了理想的菌株。此外，我們還在嘗試使用多種誘變因子進行多次誘變，以獲得更理想的菌株。
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