全基因合成是指在體外利用人工方法合成雙鏈DNA分子的技術。基因合成無需模板，是獲取基因的重要手段之壹。目前該技術主要應用在克隆壹些不易獲取模板的基因、自然界不存在的新基因以及異源基因表達上，經常在對基因密碼子優化後進行。密碼子優化的必要性及方法，已經在前面的文章中介紹，想要回顧的點這裏 密碼子優化 。
全基因合成技術很成熟，壹般的做法是：設計合成相互重疊的單鏈寡核苷酸，通過重疊延伸PCR法拼接出全長。關於全基因合成方法的資料網上壹大堆，單全基因合成的相關專利都上百篇，常見的有重疊延伸PCR（OE-PCR）法[1,7]，雙不對稱PCR（DA-PCR）法[2]，聚合酶連反應（PCR）法[3]，連接酶鏈反應（LCR）法[4]，熱力學平衡由內向外（TBIO）法[5]，PCR介導兩步（PTDS）法[6]。說實話我並沒有仔細研究這些方法，它們叫什麽名字不重要，萬變不離其宗：PCR，基於壹定重疊的短引物通過聚合酶逐漸延伸成長片段。
全基因合成最簡單的方法是什麽？
當然是讓DNA合成公司來合成，我們只需要提供DNA序列信息，他們會合成dsDNA並克隆在通用載體上，壹般還提供測序信息，確保合成的正確性。這無疑是最簡單、最省事的方法。而且現在全基因合成十分廉價，1bp不到壹塊錢還帶測序的那種。
既然DNA合成公司那麽方便，為什麽還要自己合成呢？
① 公司合成慢，壹般需要1-2周，如果碰到特殊序列比如對大腸桿菌毒性極大的編碼序列，那周期就難說了（我做過壹個核酸酶，合成公司壹個月沒搞定，自己合成壹周搞定）。
② 不自由，合成公司提供的壹般是攜帶目標基因的重組載體，拿到後還要用酶切切下來，如果基因內部含有酶切位點還需要避開，當然這些壹般不是什麽大問題，但妳確實沒得選。
③ 如前所述，全基因合成壹般用於異源基因表達，異源表達的對象大多是酶，研究酶的性質可能又需要構建大量突變體。合成公司只提供壹個序列，構建突變體還得自己設計引物重新構建，如果自己合成全基因，只需要將包含突變的引物替換掉，就可以同時獲得各類突變體，這在構建含大量突變的突變體時，更有優勢。
④ 序列需要保密，畢竟自己才最可靠。
總有人喜歡自己動手豐衣足食，本文我要介紹的是自己合成的方法，介紹兩種方法：
1 基於“搭橋”PCR的壹次拼接法
這種方法依賴於引物間的相互退火，彼此作為模板相互延伸，因此需要的引物總是壹正壹反。首先把全基因序列打斷為短的oligos，壹般不大於59bp，因為壹般引物合成以59bp為分水嶺，超過59bp價格和時間成本都會高很多。oligos靠3'末端互補序列相互退火，形成帶有gaps的雙鏈產物，再由DNA聚合酶補齊gaps，形成帶有切刻的DNA雙鏈，這種產物經過Taq DNA Ligase鏈接形成完整的雙鏈產物，依此為模板進行PCR擴增即可得到目標基因，也可以直接使用帶有切刻的DNA雙鏈作為模板進行PCR擴增。
2 基於逐漸延伸的step by step法
這種方法僅最後壹條引物為反向，其余均為正向，正向引物間具有重疊序列。倒數第壹條oligo與倒數第二條oligo靠末端互補序列相互退火，經過第壹次PCR循環，雙鏈延長，延長的雙鏈與倒數第三條oligo繼續退火、延長，......，依此類推，直至全長序列合成。這種方法理論上壹次PCR循環只能延伸壹條引物，N條oliogs就至少需要經過N個PCR循環，由於只有壹個延伸端，引物設計比方法1簡單，而且引物數目不需要必須為偶數。
⒈ 設計PCR引物
可以借助自動設計工具也可以人工設計，借助工具後面會詳細介紹。如果人工設計，推薦使用SnapGene（這款軟件的強大就不多說了，搞分子生物學應該都知道，網上有很多破解版，沒安裝的話自己去百度壹個吧），將全基因序列復制進去之後，先調出“Preferences”面板，找到“Primer”選項，把3’端最短匹配長度和最低Tm分別設置為10bp和40℃，這樣當妳添加引物時軟件就會自動提醒有沒有次級結合位點（如下圖）。
因為3’端錯配對本文中的全基因合成方法十分不利，如果這兩個設置太低實在難以設計出引物，可以適當調高至12bp和45℃，還不行的話只能優化密碼子後再重新設計。
引物的長度預設為59bp，重點是重疊區的設計，壹般應該根據重疊區的Tm來確定，不同重疊區之間的Tm平衡很重要，壹般?Tm不超過3℃，推薦把Tm設置在55-58℃之間。需要註意的是，針對本文的方法壹，引物數目必須是偶數，從序列開頭往後壹條壹條的拉，下壹條oligo的起點是上壹條的終點-重疊區，上正下反，如果最後為奇數條，要調整最後幾條長度，補出壹條反向引物。
針對方法二，從序列開頭拉壹條正向，剩余全部為反向直到末尾，也可以從末尾拉壹條反向，剩余為正向直到開頭，這種方法不用管引物數目。
⒉ PCR獲得全長產物
壹般需要兩輪PCR。第壹輪，加入少量引物，推薦50uL體系中0.5-1pmol/個oligo，10-15個循環，獲得全長模板，本輪PCR推薦使用的DNA聚合酶應該同時缺失3’-5’和5’-3’外切酶活性，這兩種活性會損傷重疊區的Tm平衡；第二輪，取1uLPCR產物做模板，加入20pmol全長上下遊引物，20-25個循環獲得目標基因，本輪PCR應使用高保真DNA聚合酶。
⒊ 克隆至表達載體
通過同源重組，酶切鏈接等方法將目標基因插入載體中，轉化大腸桿菌或其他宿主感受態細胞，獲取單克隆子。提示：在全基因合成前，壹定要針對克隆/表達載體設計好同源臂或者酶切位點，直接加在全基因序列上，否則還要單獨設計引物添加同源臂或者酶切位點。
⒋ 測序鑒定
菌體PCR鑒定陽性克隆子並挑選陽性克隆子測序，正確的克隆可用於下遊的表達和純化。
OPTIMIZER ： /GeMS ，打不開。
GeneDesign [12]：來源於《Genome Research》，論文中的鏈接是： /tools/104.html ，這個壹定打得開，這是我自己寫的工具，包括密碼子分析與優化，將基因自動轉化為oligos，生成參考實驗方案三個功能。生成的oligos，具有統壹長度，重疊區具有相同的Tm值，Tm計算公式為：Tm = 64 + 0.41×GC - 528/n，怎麽來的參考我的 《PCR引物設計大法》 。生成的oligos可以，壹鍵復制，格式為oligo+序列編號+空格+Tab+序列(5’-3’)，可以直接導入SnapGene。
我的程序輸出的引物可以被SnapGene識別，菜單欄點擊“Primer”工具，點擊”Import Primer from a List“選項，選擇從剪貼板導入序列，
可以查看個引物是否完全覆蓋目標序列，引物的“頭尾“是否沖突等等。
以GFP為目標序列測試壹下：
①從NCBI上找到GFP的序列，粘貼到文本框中，首先分析密碼子偏性；
大腸桿菌的稀有密碼子用紅色標出，可見GFP原生基因中含有很多稀有密碼子，可以先執行密碼子優化。
②生成oligos，有兩種方式，默認為方法壹，如果引物見相似性高，會提示使用方法二。
點擊生成oligos按鈕後，會彈出總堿基數的統計信息，然後輸出oliogs序號及序列，同時生成實驗方案按鈕和復制按鈕，壹鍵復制後可導入SanpGene分析。
③SanpGene分析
完全覆蓋了GFP的基因，並且為偶數條引物，引物間的Tm基本壹致（由於程序與SnapGene的Tm算法不壹致，在SnapGene上只能看到基本壹致。
④生成實驗方案
體外全基因合成壹般壹次不超過1000bp，壹次性合成太長會增加出錯的概率，我推薦按800bp分段，程序會根據妳輸入的序列長度推薦分段數。
希望這個工具能幫到妳完成全基因合成，我還寫了輔助載體構建的工具，以後有機會再介紹。
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