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全基因合成方法

全基因合成是指在體外利用人工方法合成雙鏈DNA分子的技術。基因合成無需模板,是獲取基因的重要手段之壹。目前該技術主要應用在克隆壹些不易獲取模板的基因、自然界不存在的新基因以及異源基因表達上,經常在對基因密碼子優化後進行。密碼子優化的必要性及方法,已經在前面的文章中介紹,想要回顧的點這裏 密碼子優化 。

全基因合成技術很成熟,壹般的做法是:設計合成相互重疊的單鏈寡核苷酸,通過重疊延伸PCR法拼接出全長。關於全基因合成方法的資料網上壹大堆,單全基因合成的相關專利都上百篇,常見的有重疊延伸PCR(OE-PCR)法[1,7],雙不對稱PCR(DA-PCR)法[2],聚合酶連反應(PCR)法[3],連接酶鏈反應(LCR)法[4],熱力學平衡由內向外(TBIO)法[5],PCR介導兩步(PTDS)法[6]。說實話我並沒有仔細研究這些方法,它們叫什麽名字不重要,萬變不離其宗:PCR,基於壹定重疊的短引物通過聚合酶逐漸延伸成長片段。

全基因合成最簡單的方法是什麽?

當然是讓DNA合成公司來合成,我們只需要提供DNA序列信息,他們會合成dsDNA並克隆在通用載體上,壹般還提供測序信息,確保合成的正確性。這無疑是最簡單、最省事的方法。而且現在全基因合成十分廉價,1bp不到壹塊錢還帶測序的那種。

既然DNA合成公司那麽方便,為什麽還要自己合成呢?

① 公司合成慢,壹般需要1-2周,如果碰到特殊序列比如對大腸桿菌毒性極大的編碼序列,那周期就難說了(我做過壹個核酸酶,合成公司壹個月沒搞定,自己合成壹周搞定)。

② 不自由,合成公司提供的壹般是攜帶目標基因的重組載體,拿到後還要用酶切切下來,如果基因內部含有酶切位點還需要避開,當然這些壹般不是什麽大問題,但妳確實沒得選。

③ 如前所述,全基因合成壹般用於異源基因表達,異源表達的對象大多是酶,研究酶的性質可能又需要構建大量突變體。合成公司只提供壹個序列,構建突變體還得自己設計引物重新構建,如果自己合成全基因,只需要將包含突變的引物替換掉,就可以同時獲得各類突變體,這在構建含大量突變的突變體時,更有優勢。

④ 序列需要保密,畢竟自己才最可靠。

總有人喜歡自己動手豐衣足食,本文我要介紹的是自己合成的方法,介紹兩種方法:

1 基於“搭橋”PCR的壹次拼接法

這種方法依賴於引物間的相互退火,彼此作為模板相互延伸,因此需要的引物總是壹正壹反。首先把全基因序列打斷為短的oligos,壹般不大於59bp,因為壹般引物合成以59bp為分水嶺,超過59bp價格和時間成本都會高很多。oligos靠3'末端互補序列相互退火,形成帶有gaps的雙鏈產物,再由DNA聚合酶補齊gaps,形成帶有切刻的DNA雙鏈,這種產物經過Taq DNA Ligase鏈接形成完整的雙鏈產物,依此為模板進行PCR擴增即可得到目標基因,也可以直接使用帶有切刻的DNA雙鏈作為模板進行PCR擴增。

2 基於逐漸延伸的step by step法

這種方法僅最後壹條引物為反向,其余均為正向,正向引物間具有重疊序列。倒數第壹條oligo與倒數第二條oligo靠末端互補序列相互退火,經過第壹次PCR循環,雙鏈延長,延長的雙鏈與倒數第三條oligo繼續退火、延長,......,依此類推,直至全長序列合成。這種方法理論上壹次PCR循環只能延伸壹條引物,N條oliogs就至少需要經過N個PCR循環,由於只有壹個延伸端,引物設計比方法1簡單,而且引物數目不需要必須為偶數。

⒈ 設計PCR引物

可以借助自動設計工具也可以人工設計,借助工具後面會詳細介紹。如果人工設計,推薦使用SnapGene(這款軟件的強大就不多說了,搞分子生物學應該都知道,網上有很多破解版,沒安裝的話自己去百度壹個吧),將全基因序列復制進去之後,先調出“Preferences”面板,找到“Primer”選項,把3’端最短匹配長度和最低Tm分別設置為10bp和40℃,這樣當妳添加引物時軟件就會自動提醒有沒有次級結合位點(如下圖)。

因為3’端錯配對本文中的全基因合成方法十分不利,如果這兩個設置太低實在難以設計出引物,可以適當調高至12bp和45℃,還不行的話只能優化密碼子後再重新設計。

引物的長度預設為59bp,重點是重疊區的設計,壹般應該根據重疊區的Tm來確定,不同重疊區之間的Tm平衡很重要,壹般?Tm不超過3℃,推薦把Tm設置在55-58℃之間。需要註意的是,針對本文的方法壹,引物數目必須是偶數,從序列開頭往後壹條壹條的拉,下壹條oligo的起點是上壹條的終點-重疊區,上正下反,如果最後為奇數條,要調整最後幾條長度,補出壹條反向引物。

針對方法二,從序列開頭拉壹條正向,剩余全部為反向直到末尾,也可以從末尾拉壹條反向,剩余為正向直到開頭,這種方法不用管引物數目。

⒉ PCR獲得全長產物

壹般需要兩輪PCR。第壹輪,加入少量引物,推薦50uL體系中0.5-1pmol/個oligo,10-15個循環,獲得全長模板,本輪PCR推薦使用的DNA聚合酶應該同時缺失3’-5’和5’-3’外切酶活性,這兩種活性會損傷重疊區的Tm平衡;第二輪,取1uLPCR產物做模板,加入20pmol全長上下遊引物,20-25個循環獲得目標基因,本輪PCR應使用高保真DNA聚合酶。

⒊ 克隆至表達載體

通過同源重組,酶切鏈接等方法將目標基因插入載體中,轉化大腸桿菌或其他宿主感受態細胞,獲取單克隆子。提示:在全基因合成前,壹定要針對克隆/表達載體設計好同源臂或者酶切位點,直接加在全基因序列上,否則還要單獨設計引物添加同源臂或者酶切位點。

⒋ 測序鑒定

菌體PCR鑒定陽性克隆子並挑選陽性克隆子測序,正確的克隆可用於下遊的表達和純化。

OPTIMIZER : /GeMS ,打不開。

GeneDesign [12]:來源於《Genome Research》,論文中的鏈接是: /tools/104.html ,這個壹定打得開,這是我自己寫的工具,包括密碼子分析與優化,將基因自動轉化為oligos,生成參考實驗方案三個功能。生成的oligos,具有統壹長度,重疊區具有相同的Tm值,Tm計算公式為:Tm = 64 + 0.41×GC - 528/n,怎麽來的參考我的 《PCR引物設計大法》 。生成的oligos可以,壹鍵復制,格式為oligo+序列編號+空格+Tab+序列(5’-3’),可以直接導入SnapGene。

我的程序輸出的引物可以被SnapGene識別,菜單欄點擊“Primer”工具,點擊”Import Primer from a List“選項,選擇從剪貼板導入序列,

可以查看個引物是否完全覆蓋目標序列,引物的“頭尾“是否沖突等等。

以GFP為目標序列測試壹下:

①從NCBI上找到GFP的序列,粘貼到文本框中,首先分析密碼子偏性;

大腸桿菌的稀有密碼子用紅色標出,可見GFP原生基因中含有很多稀有密碼子,可以先執行密碼子優化。

②生成oligos,有兩種方式,默認為方法壹,如果引物見相似性高,會提示使用方法二。

點擊生成oligos按鈕後,會彈出總堿基數的統計信息,然後輸出oliogs序號及序列,同時生成實驗方案按鈕和復制按鈕,壹鍵復制後可導入SanpGene分析。

③SanpGene分析

完全覆蓋了GFP的基因,並且為偶數條引物,引物間的Tm基本壹致(由於程序與SnapGene的Tm算法不壹致,在SnapGene上只能看到基本壹致。

④生成實驗方案

體外全基因合成壹般壹次不超過1000bp,壹次性合成太長會增加出錯的概率,我推薦按800bp分段,程序會根據妳輸入的序列長度推薦分段數。

希望這個工具能幫到妳完成全基因合成,我還寫了輔助載體構建的工具,以後有機會再介紹。

參考文獻

[1] Prodromou,C. and Pearl,L. (1992) Recursive PCR: a novel technique for total gene synthesis. Protein Eng., 5, 827–829.

[2] Sandhu,G.S, Aleff,R.A. and Kline,B.C. (1992) Dual asymmetric PCR: one-step construction of synthetic genes. Biotechniques, 12, 14–16.

[3] Stemmer,W.P., Crameri,A., Ha,K.D., Brennan,T.M. and Heyneker,H.L. (1995) Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene, 164, 49–53.

[4] Au,L.C., Yang,F.Y., Yang,W.J., Lo,S.H. and Kao,C.F. (1998) Gene synthesis by a LCR-based approach: high-level production of leptin-L54 using synthetic gene in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun., 248, 200–203.

[5] Gao,X., Yo,P., Keith,A., Ragan,T.J. and Harris,T.K. (2003) Thermodynamically balanced inside-out (TBIO) PCR-based gene synthesis: a novel method of primer design for high-fidelity assembly of longer gene sequences. Nucleic Acids Res.,31, e143.

[6] Xiong,A.-S., Yao,Q.-H., Peng,R.-H., Li,X., Fan,H.-Q., Cheng,Z.-M. and Li,Y. (2004) A simple, rapid, high-fidelity and cost-effective PCR-based two-step DNA synthesis method for long gene sequences. Nucleic Acids Res., 32, e98.

[7] Young,L. and Dong,Q. (2004) Two-step total gene synthesis method. Nucleic Acids Res., 32, e59.

[8] Hoover,D.M. and Lubkowski,J. (2002) DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis. Nucleic Acids Res., 30, e43.

[9] Rouillard,J.-M., Lee,W., Truan,G., Gao,X., Zhou,X. and Gulari,E.(2004) Gene2oligo: oligonucleotide design for in vitro gene synthesis. Nucleic Acids Res., 32, W176–W180.

[10] Rydzanicz,R., Zhao,X.S. and Johnson,P.E. (2005) Assembly PCR oligo maker: a tool for designing oligodeoxynucleotides for constructing long DNA molecules for RNA production. Nucleic Acids Res., 33, W521–W525.

[11] Jayaraj,S., Reid,R. and Santi,D.V. (2005) GeMS: an advanced software package for designing synthetic genes. Nucleic Acids Res., 33, 3011–3016.

[12] Richardson,S.M., Wheelan,S.J., Yarrington,R.M. and Boeke,J.D. (2006) GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes. Genome Res., 16, 550–556.

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