合的研究熱點。基因芯片技術雖然僅有幾年的發展歷史,但在生物學的諸多領域已顯示出巨大的潛力和誘人的前景。許多人認為基因芯片技術可以與單克隆抗體、PCR 技術、重組DNA 技術相媲美。針對DNA 分析的芯片又稱DNA 芯片或基因
芯片, 根據核酸分析過程中的3 個主要步驟,DNA 芯片分為3 類:用於核酸樣品制備的DNA芯片、用於核酸片段擴增反應的DNA 芯片和用於基因檢測的DNA 芯片,後者又稱微陣列,即DNA芯片。本文對基因芯片在食品致病菌檢測中的應用作壹介紹。
1 基因芯片技術檢測食品致病菌的技術原理
基因芯片的基本原理是將各種基因寡核苷酸點樣於芯片表面,微生物樣品DNA 經PCR 擴增後制備熒光標記探針,然後再與芯片上寡核苷酸點雜交,最後通過掃描儀定量和分析熒光分布模式來確定檢測樣品是否存在某些特定微生物 。
2 基因芯片技術在食品致病菌檢測中的應用
2. 1 致病菌在食品中的危害
食品在生產、運輸、銷售過程中容易受致病性微生物汙染,因此食品衛生檢驗中的壹個十分重要的內容是及時準確地檢測出食品中的致病性微生物。這些致病性微生物的存在會給消費者的健康帶來極大的危害。
2. 2 常規方法檢測食品中致病菌的不足
目前,國內外對食品微生物中病菌的檢測包括常見的致病菌,如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、誌賀菌、沙門氏菌等,常規檢測方法主要有傳統生化培養檢測法、探針雜交、PCR 法。傳統方法是采用細菌培養、生化鑒定與血清分型,由於操作簡單、經濟而被廣泛采用,但檢測時限長(壹般要1～2 周) ,效率低、靈敏度不高。探針雜交和PCR技術準確、靈敏、快速( PCR 2～4 h ,探針雜交需要的時間稍長壹些) ,彌補了傳統方法的不足,國內外關於這2 種技術在醫學微生物檢測方面的研究報道很多。但PCR 法由於假陽性影響及檢測成本昂貴而在應用中受到限制;探針雜交操作繁雜、檢測時限長,因此這兩種技術並沒有真正在實際檢測中得到大量應用。可見常規檢測方法檢測食品中的致病菌已經不能滿足快速檢測的要求,難以適應飛速發展的現代食品生產和流通領域,因此為了確保食品的安全性,開發快速檢測致病菌的方法,準確地檢測食品中的致病菌具有十分重要的意義。
2. 3 基因芯片技術檢測食品中的常見致病菌
1996 年,世界上第壹塊商業化DNA 芯片的問世,標誌著基因芯片技術進入廣泛研究和應用的階段[2 ] ,該技術具有傳統的檢測方法不可比擬的優越性3 ] : ①基因芯片可以對食品中的致病菌
實行高通量和並行檢測,壹次實驗即可得出全部
檢測結果; ②操作簡便快速,整個檢測在幾小時內
即可得出檢測結果; ③特異性強,敏感性高。隨著
基因芯片檢測食品中致病菌技術的不斷發展和完
善,將廣泛應用於出入境、食品安全指標、突發事
件等致病菌的檢測,食品安全必將得到進壹步保
障,並且將對整個食品領域產生深遠的影響。
東北農業大學動物醫學院的立廣興制備了地
高辛標記的空腸彎曲菌探針,北京醫院臨床檢驗
中心的楊華衛等研制了2 種以生物素標記對結
核分支桿菌特異性的DNA 探針[4 ] ; 李君文等[5 ]
應用基因芯片檢測水中常見致病菌:可對水中致
病菌實行高通量、並行檢測,壹次實驗即可得出全
部結果;靳連群等[6 ]利用基因芯片技術檢測腸道
中的致病菌。結果顯示制備的基因芯片能夠檢測
出沙門氏菌、誌賀菌、葡萄球菌等。對於未知菌落
利用基因芯片能夠在3 h 完成對未知菌屬的鑒
定;南開大學王磊教授[7 ] 承擔的“致病腸道細菌
—誌賀氏菌檢測基因芯片研制項目,近日取得重
大進展,該項目針對不同種誌賀氏菌特異基因及
其探針已申請專利12 項。利用基因芯片檢測食
品中誌賀菌的時間已由傳統檢測方法的6 d 縮短
到了幾小時。
Borucki 等[8 ]構建的混合基因組微陣列可準
確鑒別各種近緣單核增多李斯特菌分離物;
Volokhov 等[9 ]通過單管復合體擴增和基因芯片
技術檢測和鑒別6 種李斯特菌;Call 等[10 ]通過分
析E. coli O157 : H7 的Shiga 樣毒素Ⅰ,Shiga 樣
毒素Ⅱ及溶血素A ,發現基因芯片可準確檢測各
種E. coli O157 :H7 分離物。J ack[11 ]等通過設計
通用引物擴增細菌核糖體16S rRNA ,並將擴增
產物與含有探針的低密度芯片進行雜交,從而直
接檢測鑒定微生物。Wilson 等[12 ]采用病原體診
斷區基因擴增和20 寡核苷酸藻紅素標記探針,開
發出壹套多病原體識別微陣列,可以準確識別18
種致病性病毒、原核生物和真核生物。
2. 4 基因芯片技術檢測食品致病菌的程序
2. 4. 1 PCR 擴增引物及基因芯片探針設計 細
菌間16S rRNA 保守性強,在生物進化過程中比
其他基因演化得慢,被冠之以細菌分類的“化石”。
但細菌的16S rRNA 保守性又是相對的,在16S
rRNA 基因中既有序列壹致的恒定區,也有序列
互不相同的可變區,恒定區和可變區交錯排列。
因此可以在16S rRNA 恒定區設計PCR 引物,用
壹對引物就可以將所有致病菌的相應基因片段全
部擴增出來,可在可變區設計檢測探針並制作基
因芯片。
2. 4. 2 制備芯片 對芯片的介質表面進行氨基
化、矽烷化或二硫鍵修飾處理是基因芯片技術的
重要組成部分[13 ] 。利用基因芯片點樣儀,將引物
及探針DNA 分子點塗在經過修飾的玻片等載體
上,即制成芯片。DNA 芯片的制作有幾種不同的
方式: ①芯片外合成制備芯片,如化學噴射法和接
觸式點塗法[14 ] ; ②原位合成制備芯片,如高壓電
噴頭合成法[15 ]和光引導原位合成法[16 ] 。所用寡
核苷酸均先已合成完畢,再固定於載體上。所用寡核苷酸均是在載體上被合成與固定,使成芯片。
芯片制備好後,便可用於檢測食品中未知致病菌。
2. 4. 3 待測食品致病菌樣品處理 待測致病菌
樣品在培養後進行裂解, 提取致病菌的模板
DNA ,采用聚合酶鏈式反應(PCR) 擴增,對擴增出
來的產物進行熒光標記。再用2. 0 %瓊脂糖凝膠
電泳檢測,得到的熒光標記產物可用於雜交試驗。
2. 4. 4 雜交 將擴增後並已標記的待測致病菌
DNA 標品滴加於基因芯片上,與芯片上的特異性
DNA 進行雜交。被檢測的致病菌如果存在,其
DNA 便與芯片DNA 雜交成功,經洗滌晾幹後,進
行結果分析。
2. 4. 5 結果檢測與分析 采用芯片掃描儀,如熒
光掃描儀、***聚焦顯微鏡等進行檢測,根據熒光的
有無及強弱來確定被測致病菌是否存在。
3 基因芯片技術存在的問題及展望
基因芯片技術作為壹種新技術,具有快速、準
確、靈敏等優點,又能同時平行檢測大量樣本,但
是目前還存在壹些關鍵的問題亟待解決: ①目前
的基因芯片壹般都采用熒光標記技術,使得基因
芯片檢測不僅需要昂貴的芯片制作系統,而且需
要昂貴的激光***聚焦掃描儀,高昂的價格嚴重限
制了這種芯片技術的普及應用; ②操作復雜、費
時,對操作人員的專業素質要求比較高,這也是限
制其普及應用的障礙之壹; ③在樣品目標物放大
反應的過程中,容易造成樣品汙染,也會影響到檢
測信噪比,研究人員試圖通過生物傳感器吸附樣
品加以避免,並結合半導體技術、納米技術和生物
發光技術提高其靈敏度; ④生物芯片微細制備技
術以及如何提高生物芯片微陣列的密度也極大地
限制了該技術的市場需求,相信隨著這些技術進
壹步完善,基因芯片技術完全可能成為21 世紀最
具活力的技術之壹。
基因芯片技術在食品致病菌檢測中是壹個全
新領域,國外已開始食品致病菌檢測芯片的研究,
但仍處於早期研發階段。而在國內,該領域仍處
於初步摸索階段。基因芯片技術檢測食品中致病
菌在不久的將來必將會標準化、商品化,人們可望
在壹張芯片上檢測到幾乎所有致病菌,實現真正意義上致病菌檢測的技術革命。