哪些因素會影響目的基因在大腸桿菌中的表達？
推薦答案(1)外源基因的拷貝數
(2)外源基因的表達效率
①啟動子強度
有效②核糖體結合位點的性別
③SD序列與起始密碼子ATG的距離
④密碼子
⑶表達了產品的穩定性。
(4)細胞代謝負荷
⑸工程菌的培養條件
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建立載體，目的基因在植物的根和根細胞外表達分泌。請註明步數:842獎勵積分:20 |解決問題。
時間:2009年2月-14 09: 13 |提問者:370 629 225
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植物遺傳轉化的最終目的不是建立特定外源基因的植物表達載體，並將其轉移到受體植物中。理想的轉基因植物通常需要外源基因在特定的地點和特定的時間高水平表達，人們期待表型性狀。但在近二十年的發展過程中，往往表達效率低下，表達產物不穩定，甚至基因失活或沈默，使得轉基因植物的外源基因無法在受體植物中投入實際應用。此外，轉基因植物的安全性已經引起了許多國家的關註，例如轉基因植物的花粉傳播，抗生素選擇標記基因可能會使壹些抗生素在臨床上無用。這種高科技植物基因工程的出現，正以前所未有的時期困擾著上述問題。為了解決這些問題，近年來，人們紛紛種植轉基因技術，而廣泛的植物表達載體的探索和改進、改良和優化是其中最重要的內容之壹。綜述了本文的研究進展。
外源基因表達水平的1啟動子的選擇和轉化往往是轉基因植株不理想的重要原因。啟動子在基因表達中起著關鍵作用。因此，選擇合適的植物啟動子來提高其活性是提高外源基因表達首先要考慮的問題。
在這種植物表達載體中，廣泛使用的啟動子是組成型啟動子，例如，大多數雙子葉植物使用的CaMV35S啟動子，單子葉植物使用的泛素啟動子，以及水稻使用的Actinl啟動子。外源基因處於啟動子的控制之下，在這些元件中表達，在轉基因植物的所有部分和所有發育階段表達。但外源基因在受體植物中的表達是持續有效的，不僅造成浪費，而且往往會引起植物的形態變化，影響植物的生長發育。為了有效地發揮植物的作用，同時減少植物的不良影響，特異表達啟動子的外源基因的研究和應用越來越受到重視。已經發現，包括器官特異性啟動子在內的特異性啟動子誘導特異性啟動子。例如種子特異性啟動子、果實特異性啟動子、葉肉細胞特異性啟動子、根特異性啟動子被破壞、化學誘導特異性啟動子的光誘導特異性啟動子、熱激誘導特異性啟動子等。特異啟動子的克隆為外源基因在植物中的表達奠定了基礎。比如瑞士的CIBA-蓋基PR-IA啟動子控制轉基因煙草中Bt毒素基因的表達，啟動子水楊酸及其衍生物誘導酒精噴灑，廉價無汙染，誘導有抗性基因表達的害蟲在這個季節再次發生，顯然是非常有效的方法。
在植物轉基因研究中，往往得不到滿意的結果，尤其是在利用天然啟動子進行特異性表達和誘導表達方面，表達水平大多不理想。改造現有啟動子，構建復合啟動子將是壹個非常重要的途徑。比如Ni的轉錄激活區章魚堿合成酶基因和甘露堿合成酶基因的啟動子等。GUS表達的結果表明，修飾的啟動子的活性比35S啟動子的活性顯著提高。吳瑞等人通過操縱誘導型PI-II基因啟動子的水稻Actinl內含子組合，將新表達的啟動子活性提高了近10倍(專利)。在植物基因工程的研究中，這些人工合成的啟動起了重要的作用。
構建載體提高外源基因翻譯效率，通常是基因修飾，主要考慮三個方面:
2.1提高5’-3’-非翻譯序列的翻譯效率
許多實驗發現，真核基因的5’-3’-非翻譯序列(UTR)的正常表達是非常必要的，而該區域mRNA的穩定性和翻譯水平往往會顯著降低。如煙草花葉病毒(TMV)126 kda蛋白基因翻譯起始位點上遊由壹個68bp的核苷酸ω元件組成，提供了壹個新的核糖體結合位點，使Gus基因的翻譯活性提高了幾十倍。有許多載體在外源基因的5’-末端帶有ω翻譯增強子序列。Ingelbrecht講述了已經研究過的各種基因的3’-末端序列，發現章魚堿合成酶基因的3’-末端序列使NPTII基因的瞬時表達增加了20倍以上。此外，不同基因的基因表達增強效率在促進基因表達方面是不同的，例如RBCs 3’-末端序列的3’-末端序列是3’-末端查耳酮合酶基因的60倍以上。
2.2優化起始密碼子周圍的序列
盡管起始密碼子在生物圈中是常見的，但不同生物來源的基因都有其特殊的外部起始密碼子序列。例如，植物起始密碼子周圍的序列的典型特征是AACCAUGC，動物起始密碼子周圍的序列CACCAUG與原核生物中的序列有很大不同。科薩克對ATG相鄰定點突變的作用、起始密碼子的轉錄和翻譯進行了詳細的研究，並得出結論:ACCATGG周圍最有效序列在真核生物中的轉錄和翻譯，尤其是-3 A的進入效率非常重要。構建購買的序列，稱為科薩克序列，用於表達載體。例如，細菌幾丁質酶基因的表達水平，以及原始起始密碼子周圍的序列UUUAUGG，在煙草中增加了8倍。因此，使用來自非植物來源的基因構建體的表達載體應基於待轉化植物起始密碼子周圍序列的特征。
2.3基因的編碼區是轉化。
如果外源基因來自原核生物，由於表達機制的差異，這些基因在植物中的表達水平往往很低。例如，來自蘇雲金芽孢桿菌野生型的殺蟲蛋白基因在植物中的表達非常低。發現原核生物和植物基因mRNA穩定性的差異是由於降低。孟山都公司Perlak的前提下，氨基酸序列不變的毒蛋白，殺蟲蛋白的基因轉化，植物的密碼子選擇，GC含量，刪除原序列中影響mRNA穩定性的元素，結果，毒蛋白在轉基因植物中的表達量增加了30到100倍。
三
消除位置效應去除外源基因後，受體植物在不同的轉基因植物中通常具有非常不同的表達水平。這是外源基因在受體植物基因組中具有主要不同插入位點的結果。這就是所謂的“位置效應”。為了消除位置效應，外源基因是植物基因組在轉錄活性區的表達載體。目前的構建策略通常考慮核基質結合區的整合和定點整合技術。
核基質結合區(MAR)是壹種DNA序列，其中結合了真核細胞染色質核基質的特定部分。壹般MAR序列位於轉錄活性DNA的環狀結構中，其作用是使分裂功能，使每個轉錄單位受周圍染色質的影響而保持相對獨立的邊界。本研究表明，將MAR兩側含有MAR基因的結構遺傳轉化到植物表達載體中所需的基因構建，可以顯著提高目的基因的表達水平，減少不同轉基因植物之間表達水平的差異，降低該效應的位置。例如，Allen等人研究了異源MAR(來自酵母)和同源MAR(來自煙草)Gus基因在煙草中的表達，發現酵母MAR可以使轉基因表達的平均水平提高12倍，煙草MAR本身可以使轉基因表達的平均水平提高60倍。MAR的雞溶菌酶基因也能起到同樣的作用。
另壹個可行的方法是使用面向站點的集成技術。該技術的主要原理是改造載體宿主的染色體，通過外源基因的同源重組，將特定DNA片段的同源區域整合到染色體上。實際上，當第壹個分離的染色體轉錄活性區的DNA片段時，就構建了植物表達載體。同源重組微生物的靶向整合已成為常規的基因操作，植物中外源基因的葉綠體表達載體在動物體內也已成功整合，但核轉化方法的靶向外源整合成功案例較少。
4.葉綠體表達載體的構建
外源核轉化往往是為了克服基因表達。由於不安全的性行為問題，如核基因花粉傳播的位置效應，近幾年才出現的壹種新的遺傳轉化技術——葉綠體轉化，正是其優勢和發展前景，越來越受到人們的認可和重視。到目前為止，已經發表了五種葉綠體轉化煙草、水稻、擬南芥、馬鈴薯和油菜(侯炳凱等。)，這使得這項轉化技術成為植物基因工程中新的增長點。
經測定，各種植物葉綠體基因組序列的外源基因定點整合到葉綠體基因組中，為同源重組機制奠定了基礎，目前構建的葉綠體表達載體基本屬於特定網站的整合載體。葉綠體表達載體的構建基本上是壹個實例載體。生成葉綠體表達載體的通用外源基因的表達盒，每個連接時期的葉綠體DNA序列的兩側被稱為同源重組片段，或定位片段(定向片段)。當載體導入葉綠體時，兩個片段在葉綠體基因組中有相同的同源重組片段，是外源基因整合到葉綠體基因組中的特異場所。以作物改良為目的，葉綠體轉化需要同源重組，插入外源基因的葉綠體基因組原始序列不會造成丟失，也不會破壞原始基因的插入點。為了滿足這壹要求，已有的工作選擇了兩個相鄰基因的同源重組片段，如rbcL基因/ACCD 16 strnv/rpsl 2 PS 7 psba基因/變體1，rps7/ndhB。指定的外源基因發生同源重組後，插入相鄰的兩個基因區間，保證基因原有的功能不受影響。最近，Daniel等利用煙草葉綠體基因組tRNA和trnI的同源重組片段，構建了* * *相同載體(universal vector)。在高等植物中，因為tRNA和trnI DNA序列是高度保守的，所以作者建議這種載體可用於各種植物的葉綠體轉化。如果該載體的通用性得到證實，那麽這項工作無疑是構建壹個新的、方便實用的葉綠體表達載體的壹個好主意。
整合到葉綠體基因組中的外源基因的表達往往是由於葉綠體基因組的高拷貝數。在第壹個例子中，McBride等人將Bt的cryIA(c)毒素基因導入煙草葉綠體BT毒素蛋白的葉片中的效率高達3%至5%，而典型的核轉化技術只能實現0.001%至0.6%的總蛋白表達。最近，在Kota Kinna，Bt Cry2Aa2基因被導入煙草葉綠體。還發現煙草葉片中毒性蛋白的表達量占可溶性蛋白的2% ~ 3%，比核轉化高20 ~ 30倍。轉基因煙草不僅抗敏感蟲，還殺死了高抗蟲的。Staub最近報道，導入煙草葉綠體的人生長激素基因表達量高達葉蛋白的7%，是核轉化法的300多倍。這些實驗充分構建和轉化葉綠體表達載體，是實現外源基因高水平表達的重要途徑。
5定位信號應用程序
上述載體優化策略的主要目的是提高外源基因的轉錄和翻譯效率。但是，外源蛋白能否在植物細胞中穩定高水平表達，其他重要問題需要考慮植物遺傳轉化的積累。
最近的研究發現，如果某個外源基因被正確地定位在相連的信號序列中，該外源蛋白就可以被定向轉運到細胞中的特定位點，如葉綠體、內質網、液泡等。，可以顯著提高系統的穩定性和外源蛋白的積累。這是因為某個特定的區域嗎？某些外源蛋白的內質網提供了壹個相對穩定的環境，可以有效阻止外源蛋白的降解。例如，在Wong等人的擬南芥Rubisco亞基的轉運肽序列與具有特殊殺蟲蛋白的轉基因煙草葉綠體中積累的殺蟲蛋白基因連接之前，外源蛋白的總積累比對照組高10至20倍。最近，梁野，王松汝嫣的rbcS亞基轉運肽序列與前PHB合成基因連接，試圖使基因產物在轉基因油菜種質中積累，從而增加外源蛋白含量。、Wandelt和Stern連鎖內質網，發現外源蛋白基因的序列(四肽KDEL的編碼序列)顯著提高了轉基因植物中外源蛋白的含量。顯然，定位信號對蛋白質的積累起到了積極的促進作用，但同壹定位信號是否適用於所有的蛋白質還需要進壹步確定。
6內含子增強基因表達內含子增強基因表達。Callis等人首先發現了轉基因玉米。玉米乙醇脫氫酶基因(ADHL)的第壹內含子(內含子1)顯著增強了外源基因的表達，其他內含子(如內含子9)也有壹定的促進作用。後來vasil Lev也發現了第壹個內含子，玉米果糖合成酶基因CAT的表達水平提高了10倍。第三個內含子，水稻肌動蛋白基因，也可以由2？報告基因的表達水平增加了6倍。棗內含子增強基因表達的機制尚不清楚，但壹般認為內含子的存在可以提高加工效率和mRNA的穩定性。Tanaka等，有研究表明內含子對基因表達的增強作用主要發生在單子葉植物和雙子葉植物中，並不明顯。
由於內含子的增強，mcelroy構建了單子葉植物表達載體，特別是水稻肌動蛋白基因的第壹個內含子維持了啟動子下遊基因的表達。類似地，將Christensen等人構建的玉米泛素第壹內含子的基因置於啟動子下遊，以提高外源基因在單子葉植物中的表達。但有人指出，啟動子強度、細胞類型、目的基因序列等因素對基因表達的影響取決於特定內含子的功能，有時甚至取決於內含子在載體中的位置。例如，玉米ADHL基因9位於GUS基因的5’末端，並且在Gus基因的CaMV35S啟動子的控制下不被增強。內含子的3’端放入內含子gus基因，在同壹起始子的gus基因表達水平控制下，增加了約3倍。內含子的基因表達機制可能非常復雜。可見，如何建立內含子的高效植物表達載體缺乏固定的模式，值得進壹步研究。
多基因控制政策
到目前為止，大多數是通過引入單壹外源基因對受體植物進行遺傳轉化的研究。但足夠強大，有時由於單個基因的表達或單個作用機制，理想的轉基因植物並沒有得到。如果兩個或兩個以上的基因對植物有協同作用，同時，會獲得比單個基因更好的轉化結果。這壹策略已被應用於培育具有抗病性、抗蟲性和抗逆性的轉基因植物。比如根據昆蟲譜和抗蟲基因功能的不同機制，構建兩個功能互補的載體，通過某種方式將兩個抗蟲基因導入植物。王偉與其他凝集素基因和蛋白酶抑制劑基因壹起被同時轉移到棉花中已經含有二價抗蟲基因的轉化植株中。巴頓Bt殺蟲蛋白基因和蠍毒素基因導入煙草，大大提高了抗蟲性和防止害蟲產生抗藥性的能力(專利)。利用強大的抗病性，我們在蘭巖的實驗室構建了含有β-1，3-葡聚糖酶雙價基因和幾丁質酶基因的植物表達載體，並將其導入油菜和棉花中。結果表明，轉基因植株具有明顯的抗性。最近，馮道榮、李寶健2？三個抗真菌基因和hpt基因甚至在載體上，抗蟲基因和bar基因是否連接在另壹個載體上，基因槍壹起導入水稻的結果顯示，R的後代70%含有導入的外源基因(6？7)，以及導入的外源基因的壹個或兩個基因組位點整合的趨勢。
壹般來說，將25KB以上的外源DNA片段導入植物細胞是不可能的。功能相關基因，如植物抗病基因中的數量性狀位點，主要以基因簇的形式存在。如果將壹些大於100KB的DNA大片段，如天然植物染色體基因簇或非相鏈中的壹系列外源基因導入植物基因組中的同壹點，就可能出現由多個基因控制的現象。優良性狀可能產生廣譜抗蟲和抗病，可以獲得全新的代謝途徑，在受體細胞中產生新的生物分子。此外，基因簇的大片段或基因簇的同步插入也可以在壹定程度上克服轉基因引起的位置效應，減少基因沈默等不良現象的發生。最近，Hamilton和Alfred開發了新壹代載體系統，克隆了大的DNA片段，並在農桿菌的幫助下直接轉化了植物BIBAC和TAC。這兩個算子不僅要加快基因的圖譜克隆，還要控制多個基因，品種改良才會有潛在的應用。目前在多基因轉化中的應用研究才剛剛開始。在BIBAC和TAC載體上
8選擇使用和缺失的標記基因
標記基因的選擇遺傳轉化中可轉化的細胞(或個體)從大量未轉化細胞中選擇的標記基因。它們通常能使產生的轉基因細胞具有對選擇子產物的抗性。因此，添加了這種選擇的正常生長培養基中的轉基因細胞，由於缺乏抗性，而不是生長、發育和分化，表現出這種選擇劑的敏感性。在載體中，構建並選擇標記基因的連接側，兩者都有自己的基因調控序列(如啟動子、終止子等。).有兩種主要類型的選擇標記基因:抗生素抗性基因和除草劑抗性基因。前者會產生抗生素抗性，後者會產生抗藥性除草劑。使用的抗生素抗性基因包括NPTII基因(潮黴素抗性)、產生潮黴素磷酸轉移酶的Gent基因(新黴素磷酸轉移酶、卡那黴素抗性)和HPT基因(產生抗慶大黴素ADM)。除草劑抗性基因，包括EPSP基因(產生5-丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶，草甘膦)、GOX基因(通過草甘膦氧化酶降解草甘膦)和bar基因(產生PPT乙酰轉移酶、抗雙丙氨膦或草銨膦)。
上面的1，2，3，5，6都是可圈可點的，特別是因為妳可以選擇PB I121作為胞外分泌骨架載體，然後妳可以在上面改變基因型。
克隆步驟相對簡單。
1，第壹個限制性酶切位點，以獲得所需的基因，並且是上傳變化的良好載體。
2質粒轉化大腸桿菌DH5α擴增
用擴增良好的質粒轉化植物細胞
4.收集細胞外培養液檢測蛋白的表達和分泌。是否
至於轉化的載體，簡單說幾句就可以了。答完了，如果真的做好了載體，就可以開自己的公司了。