羅氏的454技術、illumina的Solexa/Hiseq技術和ABI的SOLID技術標誌著第二代測序技術的誕生。羅氏的454測序系統是第二代測序技術中第壹個商業化的測序平臺。
其中Illumina的市場規模占75%以上，主要有Miseq和Hiseq。下面？本文主要介紹其PE(Pair End)測序原理:
名詞:
流動池:測序反應的載體/容器。在1個流動池中有8個泳道。
泳道:測序反應的平行泳道，試劑添加和洗脫過程在此進行。
平鋪:每次熒光掃描的位置肉眼看不到。
雙端測序:序列可能有四五百bp長，兩邊都是120-150bp。
連接處:雙端測序中間的壹些未檢測到的區域。
索引(條形碼):壹個泳道通常需要測量多個樣本，每個樣本都標有特定的序列，以區分不同的樣本。
流通池結構:壹個通道包含兩個條帶，每列有60個瓦片，每個瓦片將種植不同簇，每個瓦片將在壹個循環中拍攝四次照片(每個基底壹次)。
中斷後末端會不平整，會被酶填滿，所以現在的序列是平端的。
整平完成後，用酶在3’端加上壹個特定的堿基A，加上A後，就可以利用互補配對的原理了。加上銜接子後，銜接子可分為兩部分，壹部分是測序所需的引物序列，另壹部分是文庫構建和擴增所需的引物序列。
進行PCR擴增，使我們的DNA樣本濃度足以滿足計算機要求。
Reads1和reads2不重疊。
流動池是吸附流動DNA片段的通道，測序在這裏進行。上面構建的文庫中的待測序列預先配置了壹定的濃度，當它經過這裏時，會在特定化學試劑的作用下，強烈地隨機附著在lane上，與上面的短序列配對。作為裝載的結果，lane吸附了沖走的DNA，並且它可以通過表面上的橋PCR擴增。
雙端測序的正向鏈:
為什麽Illumina測序有長度限制？
Hiseq2000序列器
測序儀配有兩個流動池，稱為雙流池。經典的Hiseq2500壹次可以產生700-800Gb的數據(其中Gb是測序堿基數，與字節數不同)。
數據量=單端讀取長度*單端讀取次數* 2(PE)
測序深度=數據大小/參考基因組大小
這是壹個新的裏程碑。以PacBio公司的SMRT和牛津納米孔技術公司的納米孔單分子測序技術為標誌，被稱為第三代測序技術。與前兩代相比，最大的特點是單分子測序，不需要PCR擴增，閱讀長度極長，平均達到10Kb-15Kb，是第二代測序技術的100倍以上。值得註意的是，在測序過程中，這些序列的閱讀長度不再相等。
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2./p/20702684
3./s/tw hwa-f 1 RNP _ xwy 66 p 12pg
4./s/9KUY43lD5miLdPZJKgRV0A