1.適馬網站
適馬已經做了人和小鼠的shRNA文庫，部分基因的shRNA序列已經得到驗證，所以直接使用適馬已經驗證的RNAi序列最為方便。
首先打開網站:/life-science/functional-genomics-and-RNAi/SiRNA/mission-pre designed-SiRNA . html，以Fli1為例，直接輸入基因名稱，點擊搜索，顯示如下界面:
在產品中找到並點擊shRNA選項，出現以下界面:
點擊“Mission shRNA慢病毒轉化顆粒”行的定價，彈出界面顯示目標基因的shRNA:
當它出現的時候，恭喜妳，這個基因已經被sigma驗證過了，下拉就能找到驗證過的shRNA構建慢病毒，簡單有效，敲除效率基本有保證。如果沒有經過驗證的shRNA，也可以根據需要選擇更多的shRNA來篩選有效的靶標。提示:邊肖傾向於選擇CDS區的shRNA，3UTR基本不選，每選壹個shRNA都會在NCBI上BLAST，保證靶的特異性。經過Blast比對，最終確認選擇了FLI1的以下兩個shRNA基因:
需要特別提醒的是，如果要將其構建成慢病毒載體，根據載體的不同，合成的shRNA引物會有些不同。sigma使用pLKO.1載體，邊肖常用SBI的pGreenPuro(CMV)載體，兩端的限制性位點為BamHI/EcoRI。設計的引物會是這樣的(不同的shRNA代替中間的紅色部分):
sense:gatcccctcttctgacatcctacatctcgagagtaggagattgtcagaaggttttttg
反義:aattcaaaaaacccttctgacatcctacatctcgagagtaggagattgtcagaagggg
2.生命技術網站
Life Technologies有壹個非常實用的在線shRNA設計軟件，操作起來非常方便，設計出來的shRNA不需要在NCBI上爆破就可以直接使用。
首先打開網站:/rnaiexpress/，在Target Design Options選擇shRNA，以Fli1為例，輸入登錄號或核苷酸序列，其他條件不變:
點擊RNAi設計，會出現推薦的10靶序列:
根據明星排名，選擇自己需要的(壹般翠花4個，不同位置各1個)，排名點擊設計shRNA Oligos:
然後在默認的環序列中選擇合適的序列(用於翠花的載體是pGreenPuro，默認沒有這個序列，以後合成引物時會去掉)，在自定義環序列中輸入CTCGAG，點擊設計:
去找shRNA
提醒:合成的引物需要微調。根據載體的要求，就像sigma的設計壹樣，需要在前後添加限制性位點，最後就完成了。