權利要求書
1、壹種對痢疾誌賀氏菌12型和大腸桿菌O152的O-抗原特異的核苷酸，其特征在
於它是如SEQ ID NO：1所示的分離的核苷酸，全長12235個堿基。
2、按照權利要求1所述的對痢疾誌賀氏菌12型和大腸桿菌O152的O-抗原特異的
核苷酸，其特征在於它是由10個基因組成，它們都位於galF基因和gnd基因之間。
3、按照權利要求2所述的對誌痢疾賀氏菌12型和大腸桿菌O152的O-抗原特異的核
苷酸，其特征在於所述的基因是：
關於轉運和加工的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因，wzy基因或與
wzy有相似功能的基因；
糖基轉移酶基因，包括orf5、orf7、orf9、orf10基因；其中所述的基因：
orf5是SEQ ID NO：1中的4626至5663堿基的核苷酸；
wzx是SEQ ID NO：1中的5663至6874堿基的核苷酸；
orf7是SEQ ID NO：1中的6877至7869堿基的核苷酸；
wzy是SEQ ID NO：1中的7882至8955堿基的核苷酸；
orf9是SEQ ID NO：1中的8960至9721堿基的核苷酸；
orf10是SEQ ID NO：1中的9718至10788堿基的核苷酸。
4、按照權利要求1-2所述的對痢疾誌賀氏菌12型和大腸桿菌O152的O-抗原特異的
核苷酸，其特征在於它是源於所述的wzx基因、wzy基因或糖基轉移酶基因orf5、orf7、
orf9、orf10基因；或糖合成路徑基因中的寡核苷酸；以及它們的混合或它們的重組。
5、按照權利要求4所述的對痢疾誌賀氏菌12型和大腸桿菌O152的O-抗原特異的核
苷酸，其特征在於所述的寡核苷酸是：
源於orf5的寡核苷酸對：
SEQ ID NO：1中的4866至4886堿基的核苷酸和5573至5591堿基的核苷酸，
SEQ ID NO：1中的5156至5176堿基的核苷酸和5587至5595堿基的核苷酸，
SEQ ID NO：1中的4641至4660堿基的核苷酸和5302至5320堿基的核苷酸；
源於wzx的寡核苷酸對：
SEQ ID NO：1中的6189至6207堿基的核苷酸和6731至6750堿基的核苷酸，
SEQ ID NO：1中的5713至5733堿基的核苷酸和6724至6741堿基的核苷酸，
SEQ ID NO：1中的6463至6481堿基的核苷酸和6821至6839堿基的核苷酸；
源於orf7的寡核苷酸對：
SEQ ID NO：1中的7024至7041堿基的核苷酸和7779至7800堿基的核苷酸，
SEQ ID NO：1中的6972至6992堿基的核苷酸和7578至7596堿基的核苷酸，
SEQ ID NO：1中的7131至7148堿基的核苷酸和7693至7674堿基的核苷酸；
源於wzy的寡核苷酸對：
SEQ ID NO：1中的7883至7903堿基的核苷酸和8903至8921堿基的核苷酸，
SEQ ID NO：1中的8049至8069堿基的核苷酸和8876至8894堿基的核苷酸，
SEQ ID NO：1中的8197至8214堿基的核苷酸和8197至8214堿基的核苷酸；
源於orf9的寡核苷酸對：
SEQ ID NO：1中的9020至9040堿基的核苷酸和9630至9647堿基的核苷酸，
SEQ ID NO：1中的8982至9000堿基的核苷酸和9443至9462堿基的核苷酸，
SEQ ID NO：1中的9165至9183堿基的核苷酸和9525至9543堿基的核苷酸；
源於orf10的寡核苷酸對：
SEQ ID NO：1中的9752至9770堿基的核苷酸和10567至10586堿基的核苷酸，
SEQ ID NO：1中的9165至9183堿基的核苷酸和9525至9543堿基的核苷酸，
SEQ ID NO：1中的9934至9952堿基的核苷酸和10513至10530堿基的核苷酸。
6、權利要求1所述的對痢疾誌賀氏菌12型和大腸桿菌O152的O-抗原特異的核苷酸
在體外檢測表達O-抗原的細菌的應用。
7、按照權利要求1所述的對痢疾誌賀氏菌12型和大腸桿菌O152的O-抗原特異的核
苷酸的應用，其特征在於它作為引物用於PCR、作為探針用於雜交反應與熒光檢測、制造
基因芯片或微陣列用於體外檢測痢疾誌賀氏菌12型或大腸桿菌O152。
8、權利要求1所述的對痢疾誌賀氏菌12型和大腸桿菌O152的O-抗原特異的核苷酸
的分離方法，其特征在於它包括下述步驟：
1)基因組的提取
在LB培養基中37℃過夜培養誌賀氏菌，離心收集細胞，用pH值為8.0的Tris-HCl
和EDTA重懸細胞，37℃溫育20分鐘後加入溶菌酶裂解細菌，加入蛋白酶K和SDS降解蛋
白質，再加入RNase去除RNA；加等體積酚抽提混合物，取上清再用等體積的酚∶氯仿∶
異戊醇抽提兩次除其中的酶和蛋白，再用等體積的乙醚抽提除去殘余的酚；用2倍體積乙
醇沈澱DNA，用玻璃絲卷出DNA後用70％乙醇洗DNA，最後將DNA重懸於30μlTE中，基因
組DNA通過0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測；
2)通過Long PCR擴增痢疾誌賀氏菌12型中的O-抗原基因簇
首先根據經常發現於O-抗原基因簇啟動子區的JumpStart序列設計上遊引物-ATT
GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT，再根據O-抗原基因簇下遊的gnd基因設計下遊引物
-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long
Template PCR方法擴增O-抗原基因簇，PCR反應程序如下：在94℃預變性2分鐘；然後
94℃變性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分鐘，這樣進行30個循環；最後，在68
℃繼續延伸7分鐘，得到PCR產物；合並6管long PCR產物，並用Promega公司的Wizard
PCR Preps純化試劑盒純化PCR產物；
3)O-抗原基因簇文庫的構建
用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構建O-抗原基因簇文庫，反應體系是300ng
PCR純化產物，0.9μl 0.1M MnCl2，1μl 1∶2000稀釋的1mg/ml的DNaseI，反應在室溫中
進行；酶切10分鐘使酶切後的DNA片段大小集中在1kb-3kb之間，而後加入2μl 0.1M EDTA
終止反應，合並4管同樣的反應體系，用等體積的酚抽提壹次，用等體積的酚∶氯仿∶
異成醇混合溶液抽提壹次，酚∶氯仿∶異戊醇混合體積比例為25∶24∶1；再用等體積的
乙醚抽提壹次後，用2.5倍體積的無水乙醇沈澱DNA，並用70％乙醇洗沈澱，最後重懸於
18μl水中；隨後在此混合物中加入2.5μl dNTP，其中包含1mMdCTP、1mMdGTP、1mMdTTP
和10mMdATP，1.25μl 100mM DTT和5單位的T4DNA聚合酶，11℃30分鐘，將酶切產物
補成平端，75℃終止反應後，加入5單位的Tth DNA聚合酶及其Tth DNA聚合酶的緩沖液，
並將體系擴大為80μl，使DNA的3’端加dA尾，此混合物經混合體積比為24∶1的氯仿∶
異戊醇混合液抽提和乙醚抽提，然後與pGEM-T-Easy載體於16℃連接24小時，總體積為
90μl，其中有25單位的T4DNA連接酶和9μl的10倍T4DNA連接酶的緩沖液，最後用1/10
體積pH＝5.2的3M NaAc和2倍體積的無水乙醇沈澱連接混合物，70％乙醇洗後溶於30μl
水中得到連接產物，用Bio-Rad公司的電轉化感受態細胞的制備方法制備感受態大腸桿
菌DH5α細胞，取2-3μl連接產物與50μl感受態大腸桿菌DH5α混合後，轉到Bio-Rad
公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時間為5.0毫秒-6.0毫秒，電擊後立即
在杯中加入1ml的SOC培養基使菌復蘇，然後將菌塗在含有氨芐青黴素、X-Gal和IPTG
的LB固體培養基上37℃過夜培養，次日得到藍白菌落；將得到的白色菌落即白色克隆轉
到含有氨芐青黴素的LB固體培養基上培養，同時從每個克隆中提取質粒並用EcoRI酶切
鑒定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群構成了痢疾誌賀氏菌12型的O-抗原基因
簇文庫；
4)O-抗原基因簇全序列的獲得
從O-抗原基因簇文庫中挑選插入片段在700bp以上的120個克隆由上海生物工程有
限公司用ABI377型DNA自動測序儀對克隆中的插入片段單向進行測序，使序列達到80％
的覆蓋率，剩余20％的序列再根據已得到的序列設計引物，再從痢疾誌賀氏菌12型的基
因組DNA中直接PCR並對PCR產物測序，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列，用英國劍
橋Medical Research Council分子生物學實驗室出版的Staden package軟件包的Pregap4
和Gap4軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到痢疾誌賀氏菌12型的O-抗原基因簇的核
苷酸全長序列，序列的質量主要由兩個方面來保證：(1)對每個基因組作6個Long PCR
反應，然後混合這些產物以產生文庫；(2)對每個堿基，保證3個以上高質量的覆蓋率；
5)O-抗原基因簇結構的獲得
用The National Center for Biotechnology Information的orffinder發現痢疾誌賀氏
菌12型O-抗原基因簇的核苷酸序列中的基因，找到10個開放的閱讀框，用blast系列
軟件與GenBank中的基因比較以發現這些開放的閱讀框的功能並確定它們是什麽基因，再
用英國sanger中心的Artemis軟件完成基因註釋，用Clustral W軟件做DNA和蛋白質序
列間的精確比對，最後得到痢疾誌賀氏菌12型的O-抗原基因簇的結構。