熒光素+ATP →熒光素酰腺苷酸)+PPi
熒光素腺苷酸+O2 →氧熒光素+AMP+光
這個反應非常節能，輸入反應的能量幾乎全部轉化為光。與人類使用的白熾燈形成鮮明對比的是，只有10%以上的能量轉化為光，其余的能量都轉化為熱能浪費掉了。
熒光素或熒光素酶不是壹個特定的分子，而是所有能產生熒光的底物及其相應酶的總稱，雖然它們是不同的。能夠控制發光的不同生物使用不同的熒光素酶來催化不同的發光反應。最廣為人知的發光生物是螢火蟲，它們所使用的不同的熒光素酶與其他發光生物的熒光素酶是不同的，比如平菇(Pleurotus ostreatus，Omphalotus olearius)或者很多海洋生物是不同的。在螢火蟲體內，發光反應所需的氧氣是從壹個叫做腹部氣管的管子輸入的。壹些生物，如磕頭蟲，含有多種不同的熒光素酶，可以催化相同的熒光素酶底物，發出不同顏色的熒光。螢火蟲有2000多種。然而，在瓢蟲總科中還有許多其他昆蟲(包括螢火蟲、磕頭蟲和相關昆蟲)，因此它們的熒光素酶對於分子系統學非常有用。目前，研究最徹底的熒光素酶是來自Photinini螢火蟲科的北美螢火蟲(Photinus pyralis)。
熒光素酶
又稱發光酶，是催化生物發光的酶系統的總稱。它是壹種高分子成分，在輕物質的冷水提取物在氧氣中發光，底物熒光素被消耗後，對熱不穩定。目前研究最多的是螢火蟲和發光細菌熒光素晶體。它們屬於加氧酶，不含金屬和輔酶。為了發光，有些酶必須以ATP為輔助因素。其他人沒有。眾所周知，螢火蟲的發光機制因物種不同而有很大差異。熒光素酶具有高度特異性，通常只作用於相關物種的熒光素酶。當然，螢火蟲和螢火蟲的酶是不能互相替代引起發光的。螢火蟲的螢光素酶在幹燥狀態下相當穩定，可以保存。
雙熒光素酶報告基因檢測:結合螢火蟲和海洋腔腸動物熒光素酶的先進* * *報告基因檢測技術
當螢火蟲熒光素酶用於定量基因表達時，通常使用第二個報告基因來減少實驗中的變異因子。然而，傳統的* * *報告基因(如CAT、β-Gal、GUS)由於其不同的測試化學、處理要求和檢測特性而不夠方便。Promega提供了先進的雙報告基因技術。結合螢火蟲熒光素酶試驗和海洋腔腸動物熒光素酶試驗，雙熒光素酶報告基因檢測系統，結合pRL載體系統，表達第二報告基因海洋腔腸動物熒光素酶，在單管中進行雙熒光素酶報告基因檢測，快速、靈敏、簡便。該系統還提供PLB裂解物來裂解在多孔板中培養的哺乳動物細胞，而無需操作單個樣品。對於使用螢火蟲熒光素酶報告基因載體的研究人員來說..
介紹
雙報告基因用於實驗系統中的相關或比例檢測，通常壹個報告基因用作內部對照，以便另壹個報告基因的檢測是壹致的。當檢測基因表達時，通常使用雙報告基因來瞬時轉染培養的細胞，並且具有實驗報告基因的載體轉染具有不同報告基因的第二載體作為對照。通常，實驗報告基因與受調控的啟動子偶聯。研究調控基因的結構和生理基礎。報告基因表達活性的相對變化與偶聯調控啟動子轉錄活性的變化有關。與組成型啟動子偶聯的第二個報道基因提供了轉錄活性的內部控制，因此試驗不受實驗條件變化的幹擾。
通過這種方法，可以降低由內部變化因素削弱的實驗準確性，例如培養細胞的數量和活力以及細胞轉染和裂解的效率的差異。
近年來，螢火蟲熒光素酶與氯黴素乙酰轉移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)或葡萄糖醛酸酶(GUS)的雙報告基因結合使用已經得到廣泛應用。然而，這些雙報告基因的組合削弱了熒光素酶操作的優勢，如熒光素酶測試和定量可以在幾秒鐘內進行，但CAT，β-Gal和GUS測試方法，此外，這些報告基因受到其靈敏度和線性響應範圍的限制，因此必須註意不要超過這些範圍，內源性細胞活力也會幹擾此類報告基因的使用。許多類型的細胞具有內源性β-Gal或GUS表達，這不利於報告基因的準確定量表達。細胞內脫乙酰酶活性幹擾CAT活性試驗。雖然高溫預處理細胞裂解液(1，2)會減少內源性β-Gal和CAT試驗的幹擾，但這些處理也會使熒光素酶迅速失活。因此，在這種雙報告基因檢測中，需要在不同的步驟中處理用* * *轉染的細胞裂解物。
理想的雙報告基因方法應該使用戶能夠以螢火蟲熒光素酶的速度、靈敏度和線性範圍同時測定同壹樣品中的兩種報告基因。這在傳統的報告基因，如CAT、β-Gal和GUS中是不可能的，因為它們在測試化學中的固有限制。相反，結合firefly (Pyraris)和Renilla reniformis，Promega的雙熒光素酶報告基因測試(DLR)系統可以滿足這些要求，並在單個試管中完成這些測試。
雙熒光素酶報告基因測試化學
螢火蟲和海洋腔腸動物熒光素酶都具有生物發光報告基因的優良測試特性，但它們的進化起源不同，因此它們具有不同的酶結構和底物要求。這些差異用於開發DLR測試化學，並選擇性區分這兩種生物發光報告基因的活性。螢火蟲熒光素酶是壹種具有61kDa亞基的蛋白質。酶活性可在翻譯後用作遺傳報告基因，無需翻譯後修飾(3，4)。在ATP、Mg 2+和O 2的存在下，通過甲蟲熒光素的氧化反應發光(圖1)。在常規反應條件下，當熒光素發生氧化時，以熒光素-AMP為中間體的轉化非常緩慢。結果，在底物和酶混合後，測試化學產生“閃爍”光，這種光迅速衰減。獲得專利的測試試劑，可以量化螢火蟲熒光素酶的活性，添加輔酶A(CoA)來增強快速的酶轉化，以改善反應動力學(5)，從而產生連續的“閃爍”發光信號(圖2)。
圖1螢火蟲和海腎螢光素酶催化的生物發光
海洋腔腸酶是壹種36 kDa的蛋白質，從天然來源腎形海腎中純化得到(6)，含有3%的碳水化合物。但像螢火蟲熒光素酶，其活性在翻譯後無需翻譯後修飾即可作為遺傳報告基因。海洋腔腸酶催化的發光反應，使用O _ 2和腔腸素(圖1)，當DLR測試化學用於實驗時，海洋腔腸素反應的動力學產生閃爍發光信號，在檢測過程中緩慢衰減(圖2)。
在DLR測試系統中，用單壹裂解物逐步測量螢火蟲和海洋腔腸動物的熒光素酶活性。螢火蟲熒光素酶活性(“實驗”報告基因)測定後，螢火蟲的發光迅速湮滅，同時海洋腔腸動物熒光素酶的發光反應被激活(“對照”報告基因)。因此，DLR測試系統整合了兩種測試化學物質來快速定量* * *表達的兩種報告基因。
螢火蟲熒光素酶試驗的線性範圍延伸到酶濃度的8個數量級，可測定實驗報告基因酶≤1fg(約10 -20 mol)(圖3A)。利用雙熒光素酶報告基因檢測系統，海洋腔腸動物熒光素酶的線性範圍達到酶濃度的7個數量級，下限≤ 10fg。
用雙熒光素酶報告基因檢測螢火蟲和海腎熒光素酶產生的發光。用pGL3轉染CHO細胞(1×10 6 /60mm培養板)。
對照和pRL SV40載體DNA。用PBS洗滌細胞後，加入400μl PLB以制備裂解物。將20μl小細胞裂解液與100μl熒光素酶測試試劑II(LARII)混合，熒光光度計立即檢測螢火蟲熒光素酶的活性(細線示蹤)5438+000μl stop &；將Glo TM試劑加入熒光照度計的管中，以消除螢火蟲熒光素酶反應並同時激活海腎熒光素酶反應，並且立即檢測海腎熒光素酶的活性(粗線追蹤)。Turner Designs 20/20型熒光照度計配有計算機以追蹤熒光發射，該測試在65438±02秒內完成兩次。
雙熒光素酶報告基因檢測系統的方法
可以在制備裂解溶液後立即定量來自兩個報告基因的熒光素酶的發光信號，並且沒有必要將樣品分成小組或進行額外的處理。因為海洋腔腸動物和螢火蟲熒光素酶都顯示閃爍反應動力學，所以雙熒光素酶報告基因測試不需要帶有試劑註射器的熒光照度計。
通常，DLR測試需要大約30秒才能完成，如圖4所示。當開始螢火蟲熒光素酶報告基因測試時，將裂解產物與熒光素酶測試試劑II (LAR II)混合。當完成螢火蟲熒光素酶試驗時，螢火蟲發光湮滅，同時海洋腔腸動物熒光素酶發光被激活，停止& amp；Glo TM試劑到樣本管。在1秒內，停止&；Glo TM試劑湮滅滴度大於1.05的螢火蟲反應發光信號(圖5)，同時激活海洋腔腸動物熒光素酶。
圖3螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶發光反應的線性範圍。純化的螢火蟲和海腎螢光素酶用含1mg/ml BSA的1×PLB連續稀釋。配備有計算機的Turner Designs熒光照度計用於檢測65438±00秒的總熒光。在前2秒的預讀延遲後，直接檢測兩種高濃度熒光素酶的發光反應時，在熒光照度計的樣品室中加入中性密度濾光片。在含有10fg和100fg的海腎螢光素酶反應中，減去了來自海洋內腔螢光素酶自發光的背景信號。兩種熒光素酶的發光活性相對於它們各自的測試變化濃度作圖。
圖4。用手動熒光照度計或配有試劑取樣器的熒光照度計進行雙熒光素酶試驗的方法。例如，如果熒光照度計配備了兩個取樣器，則裂解物被預先包裝到熒光照度計的管中，然後熒光素酶測定試劑II (LAR II)，stop & amp；GloTM試劑。
PLB裂解物
PLB裂解液緩沖液，特別設計，可有效裂解培養的哺乳動物細胞，無需刮擦貼壁細胞或凍融循環。雖然PLB被設計用於被動裂解過程，但其可靠的裂解效果也有益於通過常規處理方法制備的裂解物。無論使用何種裂解方法，對於培養的哺乳動物細胞，釋放到PLB裂解液中的螢火蟲和海洋腔腸動物酶報告酶都是定量和可靠的(圖6)。被動裂解物的壹個明顯優點是可以抑制低水平的非酶發光(自發光)，這是海洋腔腸動物在水溶液中的固有特征。常用於制備細胞裂解液的試劑能增強海洋腔腸動物的自發光，包括Triton？X-100，Promega的細胞培養裂解試驗？(CCLR)和報告基因切割試劑(RLB)，它們也能顯著抑制海洋腔腸動物熒光素酶的發光反應。PLB是專門為最大化熒光素酶活性和最小化自發光而設計的，它可以提供最佳的測試靈敏度，並定量非常低水平的海洋腔腸動物熒光素酶。此外，PLB抑制起泡，這非常適合於高通應用，並可用於自動系統中，以將在多孔板中培養的細胞群制備成裂解物並對其進行測試。
圖5雙熒光素酶報告基因測試系統消除螢火蟲熒光素酶發光並激活海腎熒光素酶發光。CHO細胞裂解物含有* * *轉染的pgl 3-對照和pRL SV40載體DNA，其根據圖2中描述的方法制備。在10秒內檢測螢火蟲熒光素酶(報告基因1)和海腎熒光素酶(報告基因2)的活性。Glo TM試劑湮滅報告基因1的高效性，加入等體積的stop & amp；Glo TM試劑(沒有海洋腔腸素，海腎螢光素酶反應不能被激活)，螢火蟲螢光素酶發光被湮滅而不激活海腎螢光素酶發光。在該實驗中，被消滅的螢火蟲熒光素酶反應的殘余發光小於未受損傷的反應值的0.0004%。