1 用於培養流感病毒的細胞1?1 細胞株的選擇 在最初培養流感病毒的時候用雞胚,但雞胚分離流感病毒容易引起病毒便變異和過敏性反應,還存在大規模生產時外源病毒的汙染問題。而運用Vero和MDCK細胞培養流感病毒不但解決了上述問題,還使得病毒的免疫原更穩定。戚鳳春[1]等人研究發現,相同的實驗條件下,在MDCK細胞上培養的病毒HA滴度明顯高於Vero細胞,因此我們培養流感病毒細胞株的選擇MDCK細胞,其代數最好小於35代,細胞過老會使病毒不容易負載。 1?2 細胞最佳負載病毒的胞齡 MDCK細胞繁殖非常旺盛,必需只能提前壹天將細胞培養瓶裏的細胞接種在六孔板中,如果負載病毒用胞齡為兩天的MDCK細胞,那麽病毒培養的陽性率幾乎為0,而胞齡為12-24h的MDCK細胞對病毒的負載陽性率區別不大[2]。1?3 細胞負載病毒的最佳密度 首先,MDCK細胞的密度不能太稀,這種細胞密度太稀則不能生長,也不能讓細胞密得堆積起來,那樣也會很大程度降 低病毒接種的陽性率。最好使細胞剛剛鋪滿孔,這時負載病毒後收獲病毒的HA滴度最高。當工作人員提前壹天將細胞接種在6孔板中時,應考慮細胞的生長速度,使其第二天負載病毒時的細胞密度適當。其次,MDCK細胞接種六孔板時要密度均勻,容易出現的情況是細胞都聚集在孔的邊緣,而中間密度過稀,這樣也會影響病毒負載的陽性率。避免這種情況出現就要工作人員手法熟練,如果出現了這種情況,將培養板輕輕晃動(避免液體濺出),能有效改善細胞的分布。2 培養流感病毒的試劑 用於培養流感病毒試劑的不同也會很大程度影響病毒培養 陽性率。首先,不使用過期的試劑;其次,最好使用知名廠家的試劑,比如GIBCO等;再次,使用前將試劑從冰箱拿出壹段時間,最好等試劑的溫度已經平衡到室溫再用。如果是給細胞換代,過冷的試劑會影響細胞的生長狀態;如果是負載病毒前洗細胞用,過冷的試劑會使細胞突然皺縮而病毒培養的陽性率。3 樣品 3?1 樣品的存放 樣品存放的時間直接影響病毒負載的陽性率,標本越新鮮,病毒培養的陽性率越高。如果樣品不能及時負載細胞,應將樣品放在-70!冰箱中,避免反復凍融,凍融次數越多,病毒培養的陽性率越低。註意不能將樣品放在-20!的冰箱中,流感病毒在-20!非常不穩定,如果當天的樣本要第二天才能接種,應將樣品放在4!冰箱中。3?2 樣品的無菌處理 因為樣品的采樣條件不可能無菌,雖然采樣液中有抗生素,也不能保證細菌全被殺死,所以陽性樣本最好過濾到無菌的1?5ml離心管中備用。有些工作人員采用往細胞培養板中加抗生素避免汙染,這樣雖然省事,但會對細胞有傷害,從而降低了病毒培養的陽性率。4 病毒負載的操作步驟4?1 細胞洗滌 將六孔板中的細胞培養液倒去,用HBSS洗滌每壹孔三遍以上,其作用是洗去殘留的FBS,FBS通過抑制胰酶而抑制流感病毒的復制。將洗液倒去後,應立即加入洗液或病毒液,過長時間將細胞暴露在空氣中將很大程度降低病毒培養的陽性率,最好將細胞暴露在空氣中的時間縮短在5秒以內。4?2 病毒液的接種量 病毒液的接種很有講究。負載在細胞上的病毒液應大於300u,l否則不夠蓋過整孔細胞。待37!孵育1~2h後,不管開始負載了多少體積的病毒液,都應在每孔留300ul病毒液再加入病毒培養基,若病毒液全都棄去或留得太少,會使病毒培養陽性率大打折扣;若病毒液留得太多,比如超過400u,l也會使陽性率降低很多,因為存留過多的缺損病毒會嚴重影響正常病毒的復制。4?3 病毒液的孵育時間 理論上,病毒液在37!孵育1~2h都可以,但我們發現1h還是太短,最好在1h15min加入病毒培養基,不要時間過長,那樣也會使病毒培養的陽性率降低,可能是因為采樣液的pH值和病毒培養基不同,孵育時間稍長導致細胞受到損傷。而盲傳的時候,孵育的時間可以到2h以上,因為這時候所用的病毒液也是病毒培養基,而不是采樣液。4?4 病毒培養基的配制 病毒培養基是用DMEM加入HEPES和胰酶配制而成的,HEPES的作用是加強體系的緩沖能力,胰酶的作用是將病毒粒非裂解型的HA0變成裂解型的HA1+HA2,從而提高流感病毒在細胞中的復制能力,因為流感病毒只有血凝素(H)是裂解型的才具有感染性。但是HEPES和胰酶在DMEM在4!***存時間過長會引起pH值上升,所以病毒培養基我們壹般都是現配現用。 4?5 病毒HA滴度的測定 CPE出現時間隨病毒的型別和毒株的差異以及感染量的大 小而異。我們將標本接種後3d觀察是否出現CPE,出現CPE的測定HA滴度,滴度大於8則收獲病毒,用HI實驗測定病毒亞型,病毒滴度小於8進行盲傳,再在第3d測定HA滴度。若負載病毒7d還不出現CPE,維持液中又查不出HA活性,可認為陰性標本,棄之。3d時間出現病毒滴度的 最高峰, 4d和2d都低於3d時病毒的滴度。收獲毒株前,將 細胞於-80!/37!凍融壹次,有利於增加病毒的HA滴度。
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