怎樣培養流感病毒

1 用於培養流感病毒的細胞1?1 細胞株的選擇在最初培養流感病毒的時候用雞胚,但雞胚分離流感病毒容易引起病毒便變異和過敏性反應,還存在大規模生產時外源病毒的汙染問題。而運用Vero和MDCK細胞培養流感病毒不但解決了上述問題,還使得病毒的免疫原更穩定。戚鳳春[1]等人研究發現,相同的實驗條件下,在MDCK細胞上培養的病毒HA滴度明顯高於Vero細胞,因此我們培養流感病毒細胞株的選擇MDCK細胞,其代數最好小於35代,細胞過老會使病毒不容易負載。 1?2 細胞最佳負載病毒的胞齡 MDCK細胞繁殖非常旺盛,必需只能提前壹天將細胞培養瓶裏的細胞接種在六孔板中,如果負載病毒用胞齡為兩天的MDCK細胞,那麽病毒培養的陽性率幾乎為0,而胞齡為12-24h的MDCK細胞對病毒的負載陽性率區別不大[2]。1?3 細胞負載病毒的最佳密度首先,MDCK細胞的密度不能太稀,這種細胞密度太稀則不能生長,也不能讓細胞密得堆積起來,那樣也會很大程度降低病毒接種的陽性率。最好使細胞剛剛鋪滿孔,這時負載病毒後收獲病毒的HA滴度最高。當工作人員提前壹天將細胞接種在6孔板中時,應考慮細胞的生長速度,使其第二天負載病毒時的細胞密度適當。其次,MDCK細胞接種六孔板時要密度均勻,容易出現的情況是細胞都聚集在孔的邊緣,而中間密度過稀,這樣也會影響病毒負載的陽性率。避免這種情況出現就要工作人員手法熟練,如果出現了這種情況,將培養板輕輕晃動(避免液體濺出),能有效改善細胞的分布。2 培養流感病毒的試劑用於培養流感病毒試劑的不同也會很大程度影響病毒培養陽性率。首先,不使用過期的試劑;其次,最好使用知名廠家的試劑,比如GIBCO等;再次,使用前將試劑從冰箱拿出壹段時間,最好等試劑的溫度已經平衡到室溫再用。如果是給細胞換代,過冷的試劑會影響細胞的生長狀態;如果是負載病毒前洗細胞用,過冷的試劑會使細胞突然皺縮而病毒培養的陽性率。3 樣品 3?1 樣品的存放樣品存放的時間直接影響病毒負載的陽性率,標本越新鮮,病毒培養的陽性率越高。如果樣品不能及時負載細胞,應將樣品放在-70!冰箱中,避免反復凍融,凍融次數越多,病毒培養的陽性率越低。註意不能將樣品放在-20!的冰箱中,流感病毒在-20!非常不穩定,如果當天的樣本要第二天才能接種,應將樣品放在4!冰箱中。3?2 樣品的無菌處理因為樣品的采樣條件不可能無菌,雖然采樣液中有抗生素,也不能保證細菌全被殺死,所以陽性樣本最好過濾到無菌的1?5ml離心管中備用。有些工作人員采用往細胞培養板中加抗生素避免汙染,這樣雖然省事,但會對細胞有傷害,從而降低了病毒培養的陽性率。4 病毒負載的操作步驟4?1 細胞洗滌將六孔板中的細胞培養液倒去,用HBSS洗滌每壹孔三遍以上,其作用是洗去殘留的FBS,FBS通過抑制胰酶而抑制流感病毒的復制。將洗液倒去後,應立即加入洗液或病毒液,過長時間將細胞暴露在空氣中將很大程度降低病毒培養的陽性率,最好將細胞暴露在空氣中的時間縮短在5秒以內。4?2 病毒液的接種量病毒液的接種很有講究。負載在細胞上的病毒液應大於300u,l否則不夠蓋過整孔細胞。待37!孵育1~2h後,不管開始負載了多少體積的病毒液,都應在每孔留300ul病毒液再加入病毒培養基,若病毒液全都棄去或留得太少,會使病毒培養陽性率大打折扣;若病毒液留得太多,比如超過400u,l也會使陽性率降低很多,因為存留過多的缺損病毒會嚴重影響正常病毒的復制。4?3 病毒液的孵育時間理論上,病毒液在37!孵育1~2h都可以,但我們發現1h還是太短,最好在1h15min加入病毒培養基,不要時間過長,那樣也會使病毒培養的陽性率降低,可能是因為采樣液的pH值和病毒培養基不同,孵育時間稍長導致細胞受到損傷。而盲傳的時候,孵育的時間可以到2h以上,因為這時候所用的病毒液也是病毒培養基,而不是采樣液。4?4 病毒培養基的配制病毒培養基是用DMEM加入HEPES和胰酶配制而成的,HEPES的作用是加強體系的緩沖能力,胰酶的作用是將病毒粒非裂解型的HA0變成裂解型的HA1+HA2,從而提高流感病毒在細胞中的復制能力,因為流感病毒只有血凝素(H)是裂解型的才具有感染性。但是HEPES和胰酶在DMEM在4!***存時間過長會引起pH值上升,所以病毒培養基我們壹般都是現配現用。 4?5 病毒HA滴度的測定 CPE出現時間隨病毒的型別和毒株的差異以及感染量的大小而異。我們將標本接種後3d觀察是否出現CPE,出現CPE的測定HA滴度,滴度大於8則收獲病毒,用HI實驗測定病毒亞型,病毒滴度小於8進行盲傳,再在第3d測定HA滴度。若負載病毒7d還不出現CPE,維持液中又查不出HA活性,可認為陰性標本,棄之。3d時間出現病毒滴度的最高峰, 4d和2d都低於3d時病毒的滴度。收獲毒株前,將細胞於-80!/37!凍融壹次,有利於增加病毒的HA滴度。