基因動物是指將外源基因穩定整合到染色體基因中,並能通過實驗導入穩定表達的壹類動物。從65438到0974,Jaenisch在世界上首次通過顯微註射成功獲得了SV40DNA轉基因小鼠。之後,科斯坦蒂尼將兔珠蛋白基因註入小鼠受精卵,使受精卵發育成小鼠並表達兔珠蛋白。Palmiter等人將大鼠生長激素基因導入小鼠受精卵中,獲得“超級”小鼠;丘奇獲得了第壹頭轉基因奶牛。迄今為止,人們已經成功地獲得了轉基因小鼠、雞、山羊、豬、羊、牛、青蛙和多種轉基因魚。
1.轉基因動物技術
原核顯微註射1.1
又稱DNA顯微註射,即通過顯微操作器用註射器將外源基因直接註射到受精卵中,將外源基因整合到DNA中,發育成轉基因動物。它的創始人是Jaenisch和Mintz。Gordon等人和Palmiter等人通過這種方法相繼獲得了轉基因動物。這種方法目前應用廣泛,對轉基因動物的研究多基於Palmiter等方法。王(1996)報道了用顯微註射法將抗鼠疫病毒的核酸酶基因導入兔體內獲得轉基因兔。KrimPenfort通過體外胚胎培養和顯微註射獲得轉基因牛。
該方法的特點是外源基因導入整合效率高,無需載體直接轉移目的基因,目的基因長度可達
1.2轉錄病毒載體法
將目的基因重組到逆轉錄病毒載體中,制成高濃度病毒顆粒,在胚胎著床前或著床後人工感染胚胎,或直接將胚胎與能釋放逆轉錄病毒的單層培養細胞孵育達到感染目的,通過病毒將外源目的基因插入宿主基因組DNA中。通過這種方法,斯萊特等人得到了轉基因雞,哈斯克爾得到了轉基因牛。
重組DNA技術改造的逆轉錄病毒在應用上優於顯微註射法:不需要重排,可以在整合點整合單個拷貝的轉移基因;將胚胎置於高濃度病毒容器中,或與感染細胞體外共培養,或顯微註射入雞胚盤,整合逆轉錄病毒DNA的胚胎率較高。缺點是:需要用轉基因生產逆轉錄病毒;插入逆轉錄病毒的基因有壹定的大小限制;獲得的轉基因家畜嵌合性高,需要大量雜交建立轉基因品系;轉基因表達的問題還沒有解決。
1.3胚胎幹細胞(簡稱ES細胞)將基因導入胚胎;然後將細胞註入動物囊胚後,轉基因胚胎可以參與宿主的胚胎形成,形成嵌合體,直至達到物種嵌合體。因此,它可以作為載體導入外源基因,獲得轉基因動物。即由早期胚胎的內細胞團通過體外培養建立的多能細胞系。
其優點是:在將胚胎幹細胞移植入胚胎之前,可以在體外選擇特定的基因型;外源DNA轉染後,可以在細胞中克隆胚胎,然後篩選含有整合外源DNA的細胞進行細胞融合,就可以獲得許多遺傳上完全相同的轉基因動物。缺點是許多嵌合體轉基因動物的生殖細胞中不含轉基因;
目前,胚胎細胞介導法在小鼠中的應用已經成熟,但在大型動物中的應用較晚。Evans等人(1981)利用不同的培養體系,從小鼠囊胚的內細胞團中分離並建立了多能幹細胞克隆。Stice和
Strelchenko等人(1996)獲得了牛胚胎幹細胞。