1.1 實驗材料
1.1.1 原輔材料
蠶絲、葛根、枳枸子、烏梅均購於徐州市場。蔗糖、中性蛋白酶（130000 u/g）、胰蛋白酶（4000 u/g）由實驗室提供，木瓜蛋白酶（650000 u/g）由廣西海發生物酶制品廠提供。
1.1.2 主要試劑
甲醛試劑、濃硫酸、濃鹽酸、氫氧化鈉、無水硫酸鈉、無水氯化鈣、氯水、鄰二甲酸氫鉀、甲基紅、硫酸銅、硼酸、牛肉膏、蛋白腖、瓊脂、食鹽、731及723陰陽離子交換樹脂和混合提示劑：1體積的亞甲基藍和 2體積的甲基紅指示劑的混合物。
1.1.3 主要設備
電熱恒溫幹燥箱、電熱恒溫培養箱、多功能粉碎機、低速大量離心機、架盤天平、磁力攪拌器、精密pH計、電子天平、數顯恒溫水浴鍋、手提式壓力蒸汽滅菌鍋、電磁爐。
1.2 實驗方法
1.2.1 工藝流程
（1）采用酸解液調配飲料的工藝流程
蠶絲脫膠→酸解→陽離子交換樹脂脫酸→絲素氨基酸
中草藥→清洗→浸提→粗濾→離心 調配→
香精、VC、蔗糖等
灌裝→封口→殺菌→冷卻→感官鑒評及衛生檢測→成品
（2）采用酶解液調配飲料的工藝流程
蠶絲脫膠→CaCl2溶解絲素→酶解→滅酶→去CaCl2→絲素氨基酸
中草藥→清洗→浸提→粗濾→離心→調配→灌裝
香精、VC、蔗糖等
→封口→殺菌→冷卻→感官鑒評及衛生檢測→成品
1.2.2 蠶絲脫膠的方法
將洗凈烘幹後的蠶絲在Na2CO3溶液（0.4%，0.5%，0.6%）煮沸處理（20min，30min，40min），確定最佳脫膠條件。
1.2.3 絲素酸解的方法
將脫膠後的絲素烘幹做單因素實驗。先選酸度為3M，固液比1∶50，111℃下酸解15h，測定每小時的氨基酸含量，可得到酸解時間的適宜範圍；再選定固液比1∶50，酸解時間在以上確定範圍內，110℃下采取1.0M、1.5M、2.0M、2.5M、3.0M、3.5M、4.0M、4.5M、5.0M等不同濃度酸解，可選出適宜的酸濃度範圍；最後選定酸濃度與時間在適宜範圍內，通過選定不同固液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80，確定最適宜固液比範圍。將得到的酸濃度、固液比、酸解時間分別在適範圍內選3個水平做3因素3水平的正交實驗，由此來找出最佳酸解條件。
1.2.4 絲素在CaCl2中的溶解
配制不同濃度（30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、）的CaCl2溶液，測定絲素在其中的溶解效果，找出溶解絲素的CaCl2最佳濃度。
1.2.5 酶解工藝的研究方法 （1）最佳水解酶選擇。使蠶絲蛋白液在3種蛋白酶的最適加酶量、酶解溫度、酶解pH值及相同酶解時間下進行酶解，比較3種酶的酶解效果，根據氨基酸得率選出水解效果最好的酶。（2）酶解條件確定。根據以上實驗所確定的最佳絲素蛋白酶，分別對底物濃度，pH值、溫度確定3個水平做正交實驗，以此來確定酶解最佳條件。底物濃度分別為4%、5%、6%，pH值分別為5.0，5.5、6.0，酶解溫度分別為50℃、55℃、60℃。
1.2.6 酸解液脫酸
采用732型強酸型陽離子交換樹脂對酸解液進行脫酸，待流出液使茚三酮呈紫色反應時，停止上柱，用去離子水洗滌離子交換柱，至流出液近中性，再用0.5M氨水洗脫氨基酸，至不使茚三酮顯紫色為止。
1.2.7 中草藥汁的提取
將洗凈的中草藥與純凈水按1∶10的比例在90℃水浴鍋中浸提1h，得到慮液，再在殘渣中加入8倍量的純凈水於90℃水浴中浸提0.5h，把濾液與殘渣液合並後經低速大容量離心機離心後備用。
1.2.8 飲料的調配
設計1個3因素3水平的正交試驗來選擇飲料的配方。為了對飲料進行評分，需按制品的色澤、香氣、滋味和組織狀態確定壹個評分標準。
1.2.9 飲料殺菌及衛生檢測
飲料殺菌：將成品分別在90℃下殺菌15min、20min、25min，然後置於37℃恒溫水浴培養箱中觀察其穩定性，選擇最佳殺菌時間。細菌總數的測定采用平板菌落計數法。
1.3 檢測項目及方法
蠶絲中粗蛋白的測定用微量凱氏定氮法。氨基氮含量的測定用甲醛電位法。
1.3.1 絲素酶解液脫酸效果的檢驗
采用732型強酸型陽離子交換樹脂，放入高40cm，Φ15的樹脂柱中，待流出液使茚三酮呈紫色，說明樹脂已飽和，氨基酸液流出，此時停止上柱，用去離子水洗滌離子交換柱，至流出液近中性，再用0.5M氨水洗脫氨基酸，至不使茚三酮呈色反應，說明氨基酸已脫盡。
1.3.2 陰陽離子交換樹脂去離子效果的檢測
將用CaCl2溶液溶解後的絲素蛋白液選經過柱高40cm，Φ15的陽離子交換樹脂柱去Ca2+，用NaOH溶液檢測流出液中有無Ca2+，當無白色沈澱出現時，再經過柱高40cm，Φ15的陰離子交換樹脂去除Cl-，用AgNO3檢測流出液中有無Cl-，當無白色沈澱出現時停止上柱。
2 結果與討論
2.1 蠶絲脫膠條件的確定
蠶絲中次要成分主要分布在絲膠蛋白中，為保證絲素氨基酸的質量，必須進行脫膠。絲素不溶於水，而絲膠是水溶性的。盡管絲膠有親水性，但要在水介質中將它與絲素分離開來需很長時間，且要高溫處理，為此采用Na2CO3作分離介質。其中絲膠蛋白脫去率（%）=絲膠液中蛋白質含量（g）×100%絲膠蛋白總量（g）。試驗結果如表1。
表1 Na2CO3解脫絲素蛋白正交實驗設計方案及結果
處理 時間（min） 濃度（%） 絲膠脫去率（%）
1 1（20） 1（0.4） 48.5
2 1 2（0.5） 35.7
3 1 3（0.6） 59.8
4 2（30） 1 60.3
5 2 2 100
6 2 3 100
7 3（40） 1 73.9
8 3 2 100
9 3 3 100
由表1可以看出，在0.5%NaCO3溶液中中煮沸30min脫膠效好最好。在煮沸時為防止水分蒸分，影響NaCO3濃度，需在容器上加蓋子。蠶絲脫膠後即為絲素蛋白，絲膠蛋白存在於水介質中。
2.2 酸解單因子實驗
用1g絲素在3M H2SO4，固液比1∶60，110℃下水解。從實驗中發現絲素在H2SO4中3h才能完全溶解。測定4～15h的水解情況可知，氨基酸在8～10h含量較高，10h後變化很小，甚至開始減小。
用絲素在固液比1∶60，110℃下酸解8h，比較不同H2SO4濃度與氨基氮含量的關系，結果酸解濃度太低或太高都會影響氨基酸含量，控制在3M～4M較好。
用絲素在3M H2SO4，110℃下酸解8h，測固液比對酸解的影響，由於絲素至少1∶20的固液比才能浸泡，以此為最小固液比。結果固液比在1∶50～1∶70時水解效果最好。
2.3 酸解正交試驗
從酸解單因素實驗中得知影響酸解的因素主要是酸濃度、固液比、時間，由此選定各因素的3個水平，實驗結果如表2。
表2 酸解正交試驗結果與分析
所在列 A B C
因素 時間（h） 酸渡度（M） 固液化 氨基酸得率（%）
實驗1 1（8） 1（3） 1（1∶50） 69.1
實驗2 2（9） 2（3.5） 2（1∶60） 73.2
實驗3 3（10） 3（4） 3（1∶70） 71.9
實驗4 2 1 2 87.2
實驗5 2 2 3 89.1
實驗6 2 3 1 86.5
實驗7 3 1 3 78.4
實驗8 3 2 1 80.3
實驗9 3 3 2 79.6
均值1 71.400 78.233 78.633
均值2 87.600 80.867 80.000
均值3 79.433 79.333 79.800
極差 16.200 2.634 1.367
由表2得酸解得率最高組合為A2B2C3，但從表4中得理想組合為A2B2C2，所以再做A2B2C2對照，結果測得絲素氨基酸得率為89.8%，比A2B2C3稍好，所以確定酸解最佳條件為酸濃度為3.5M，固液比1∶60，110℃下酸解9h。
2.4 CaCl2溶解絲素結果
絲素在CaCl2溶液中的溶解特性較為特別，濃度低於35%或高55%時幾乎不溶解，如表3，以40%為最佳。
表3 CaCl2濃度與絲素溶解關系
1 2 3 4 5 6 7 8
CaCl2濃度 30% 35% 40% 45% 50% 55% 60% 65%
絲素溶解度 0 14.5% 100% 32.5% 15.5% 0 0 0
2.5 最佳水解酶確定
木瓜蛋白酶pH控制在6.0，溫度為50℃，E/S=10%，底物濃度即絲素蛋白濃度為4%，進行酶 解。實驗表明：前1h酶解速度增加很快，3h達到0.07mg/ml，以後增加緩慢。胰蛋白酶在pH8.0，溫度40℃，E/S=2%，絲素蛋白濃度為4%下進行酶解。7h達到最大值0.053mg/ml。中性蛋白酶在pH7.0，溫度50℃，E/S=2%，絲素蛋白濃度為4%下酶解，3h達到0.065mg/ml。由此可知，木瓜蛋白酶水解效果最好。
2.6 木瓜蛋白酶水解絲素蛋白正交實驗
做正交試驗確定木瓜蛋白酶水解絲素蛋白的最佳條件組合。木瓜蛋白酶最佳酶解條件為pH5.5，溫度55℃，底物濃度為5%，加酶量為10%。最終1.001g絲素蛋白可得0.184g氨基酸。從絲素的酸解、酶解比較得出，酸解明顯比酶解好。
2.7 飲料調配
飲料的制作應註意風味的調整，影響本飲品風味的主要因素為氨基酸濃度、中草藥濃度、糖濃度，因此設計1個3因素3水平的正交試驗來優選飲料的配方。如表4。
表4 飲料調配結果與分析
所在列 A B C
因素 氨基酸 中草藥 糖濃度（%） 實驗結果
濃度（%） 濃度（%）
實驗1 1（0.3） 1（2） 1（8） 7.8
實驗2 1 2（3） 2（9） 7.4
實驗3 1 3（4） 3（10） 7.2
實驗4 2（0.4） 1 2 9
實驗5 2 2 3 8.5
實驗6 2 3 1 8
實驗7 3（0.5） 1 3 7.6
實驗8 3 2 1 7
實驗9 3 3 2 7.5
均值1 7.467 8.133 7.600
均值2 8.500 7.633 7.967
均值3 7.367 7.567 7.767
極差 1.133 0.566 0.367
由表4可得飲品的最佳調配配方：氨基酸濃度為0.4%，中草藥汁濃度為2%，糖濃度為9%，再加少量水蜜桃香精及VC即得成品。
2.8 飲品的貯藏穩定性試驗
本試驗在裝罐前、後都進行殺菌，且對中草藥汁進行離心，故得到的飲品澄清透明。在裝罐後通過不同殺菌時間，觀察其穩定性。分別在90℃條件下殺菌15min、20min、25min，冷卻後置於37℃恒溫培養箱內觀察。9d後均無變化，仍是澄清透明的黃褐色溶液。
為了確定最佳殺菌時間，將保藏9d後的成品做細菌檢測實驗，結果是90℃殺菌25min細菌總數為56個/ml，滿足國標要求。
3 產品質量標準
3.1 感官指標
色澤：黃褐色，均勻壹致。風味：酸甜可口，有輕微的絲素氨基酸和中草藥的苦澀味，無異味。組織形狀：汁液透明，無雜質，久置後也無沈澱出現。
3.2 理化指標
酸度：pH3.5～4.0，總菌數≤100個/ml，大腸菌數≤3個/ml，致病菌不得檢出。
4 結論
絲素酸解比酶解的氨基酸得率高，酸解得率達89.1%，而酶解只有18.1%。由於酸解比酶解操作簡便且水解液色澤、氣味均較好，所以在制作飲料時采用酸解液。確定的最佳脫膠條件為0.5%的Na2CO3煮沸處理30min，在此條件下絲膠全部脫除且絲素沒有損失。脫膠後絲素經洗滌烘幹處理後進行酸解，得到酸解最佳工藝條件為3.5MH2SO4，固液比1∶60，110℃下水解9h，氨基酸得率高達89.8%。將陽離子交換樹脂脫酸的氨基酸溶液與中草藥進行調配，得到飲料的最佳調配方案為絲素氨基酸濃度0.4%，中草藥濃度2%，糖濃度9%，VC濃度0.2%。由此制得澄清透澈、酸甜可口的黃褐色飲品。