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酵母雙雜交文庫構建和篩選-寶吉生物

“自1989年Field等人建立了第壹個基於酵母的細胞內檢測蛋白相互作用的系統以來,酵母雙雜交系統已經越來越多的應用於鑒定新的蛋白與蛋白相互作用,鑒定蛋白級聯底物以及鑒定突變對蛋白與蛋白結合的影響等。有文獻統計,目前已知的蛋白質相互作用至少有壹半是通過酵母雙雜交實驗發現的!” 而文庫篩選結果直接由文庫質量的好壞所決定,構建出高質量的文庫是得到好的篩選結果的關鍵因素。

我們擁有13年的文庫構建經驗,已完成數千個各類文庫構建,所采用的技術以及試劑盒均為市場上質量最好的文庫構建試劑,保證所構建的每壹個文庫各項指標均為市場上最高標準,我們構建文庫的成功率為98%以上。關於我們的文庫構建產品,我們承諾的指標如下,各項指標在國內各家公司裏是最高的。

上海寶吉結合多年的文庫構建經驗,強勢推出“All-Direct”文庫構建技術,我們的產品較其他構建方法(主要有takara的SAMRT方法和invitrogen的gateway方法),技術和質量上都具有極大的優勢。

關於我們的文庫構建產品,我們承諾的指標如下,各項指標在國內各家公司裏是最高的:

原始文庫庫容量大於1*10^7CFU;

平均插入片段大於1200bp;

克隆陽性率大於95%。

? 1.我們是采用同源重組的方法構建文庫,沒有經過任何的內切酶切割和連接過程,確保不會出現基因被酶切切斷的情況,能夠保證基因的完整性,而Clonetech的是用酶切連接的方式構建的。

? 2.由於我們采用的是重組的方式把cDNA重組到載體上,相對clonetech的SMART的T4連接酶的方法效率要高的多,我們承諾原始庫的庫容量在1*10^7以上。而且重組的方式假陽性很低,我們這裏有的客戶壹次測3萬個克隆,都沒有出現壹個空載的情況,我們承諾陽性率大於98%,這是酶切連接的方法遠遠無法比擬的。

? 3.Clonetech的SMART方法是用PCR的方法合成第二鏈的,由於PCR的選擇性抑制及競爭性擴增,這樣就會造成基因冗余度非常高,低豐度的基因PCR擴增不到,會丟失掉,長片段的基因也會丟失掉,另外會造成重復序列非常多,特別是起始的RNA樣本量少的情況(比如5ug RNA以下就需要進行15個循環以上的PCR擴增,大大降低文庫質量),,大大降低文庫包含的基因數量,而我們的cDNA合成方法是用多種酶在16度恒溫的條件下直接合成第二鏈的,這樣就完全忠於樣本自身的基因情況,不會人為的改變樣本內的基因情況以及基因大小,大大提到文庫的質量。

4.我們是采用的壹種高質量的反轉錄酶,該反轉錄酶是公認的最好的反轉錄酶,較clonetech的反轉錄酶具有反轉錄溫度高(55攝氏度反轉,clonetech的反轉錄酶是使用42度反轉,較高的溫度可以打開RNA的二級結構,可以獲得更長的cDNA),反轉錄效率和cDNA長度要好的多。我們承諾文庫的平均插入片段在1.3Kbp以上,最低長度也在1Kbp以上,而clonetech的SMART方法構建出來的文庫壹般只有幾百BP。

文庫構建流程:

1.RNA提取

2.mRNA提取

3.cDNA的酶促法合成

4.cDNA連接接頭

5.cDNA按長度分離

6.cDNA與酵母雙雜交文庫載體(pGADT7或者pDEST22)進行all-direct重組

7.重組產物電轉化

8.文庫檢測以及質粒提取

3.1 All-direct方法與SMART方法的比較與優勢

3.2? All-direct方法與Gateway方法的比較與優勢

25個工作日內,如需轉化酵母延長15個工作日。

備註1:該酵母文庫可以選擇增加均壹化處理步驟,我們使用DSN法均壹化方法,可以構建出高質量的均壹化酵母雜交文庫,可以大大減少後續酵母篩選的工作量和篩選效率等。

客戶構建指定的酵母雙雜交cDNA文庫,由客戶提供組織、細胞或總RNA給我們即可:

細胞樣本:細胞數量大於1*10^7

動物樣本:大於1g

植物樣本:大於2g

總RNA:大於200ug

目前我們已經成功完成數千個不用樣本的文庫構建,主要客戶為中國科學院上海植物生理生態研究所、上海交通大學、浙江大學、浙江省農科院、山東省農科院等多家單位完成酵母雙(單)雜交文庫構建服務,物種包括人、小鼠、大鼠、水稻、擬南芥、牡丹、稻飛虱、蘋果、油菜、小麥、貝殼、葡萄、真菌等。

我們是國內極少數能同時提供文庫構建和文庫篩選的公司,對於酵母雙雜交篩選服務,您只需要提供誘餌基因序列即可,我們會進行以下工作,篩選的報價為3萬元整:

1.誘餌載體的測序驗證以及構建到雙雜交篩選載體上

2.誘餌基因的自激活檢測,檢測通過後繼續下壹步實驗。

3.誘餌質粒轉化酵母細胞,驗證合格後再轉化文庫質粒

4.酵母篩選和3AT條件優化

5.篩選結果的測序

6.篩選結果的回轉驗證

7.篩選結果遞交:包括篩選報告,篩選結果的測序結果和blast結果,篩選結果克隆的質粒實物。

9.1.如何選擇合適的文庫構建方法進行建庫?

※ 我們是市場上唯壹可以同時提供3種文庫構建方法的公司,這也足以看出我們公司的技術實力。

※ 3種方法的比較如下:

? 1) Clonetech 的SMART方法,該方法基本是被淘汰的,我們上文有詳細的技術比較,其唯壹的好處就是RNA的起始量可以很小,壹般只需要幾ug即可,該方法成本很低,壹般不建議選擇。

? 2) Invitrogen的方法,該方法質量上較SMART方法要好很多,其對試劑的質量要求也很高,必須全部使用invitrogen的原廠試劑。我們全部使用invitrogen公司試劑進行構建,且做了壹些技術改進,提高了文庫質量。該方法對起始的RNA要求較高,建議起始用量是大於200ug。但該方法有壹個嚴重的缺點,就是需要進行兩次重組才能得到酵母文庫,而多壹次重組就會多壹次文庫擴增過程,會嚴重影響文庫質量。在上文中有詳細的技術比較和介紹。

? 別的使用該方法建庫的公司,只能完全使用商業化的試劑盒構建文庫,沒有做任何改進。且由於進貨渠道的原因,試劑盒內的有些試劑他們是買不到的,質量就會大打折扣。比如DH10B 電轉化感受態細胞,這個感受態細胞轉化效率比國產的高出100倍以上。這個感受態細胞需要具有很多的海關批文才能買到,其他公司由於沒有相關資質,是無法進口的。

? 3) All-Direct專利方法,這個是我們的獨家專利方法,是在invitrogen方法上做了重要改進,保留了其優點(不用PCR擴增,文庫保真度高),去除了其需要經過兩次重組的缺點,大大提高文庫質量。平均長度較invitrogen方法可以提高200bp,庫容量可以提高10倍以上。該方法對RNA的要求量和invitrogen方法壹樣。

9.2.寶吉生物提供的酵母雙雜文庫有哪些產品內容?

※ 我們提供的文庫產品,包含了文庫質量(大於200ug)以及大腸桿菌文庫甘油菌。同時可以選擇提供轉化到酵母細胞的文庫甘油菌,我們會提供100只轉化到酵母細胞的文庫甘油菌,可以做100次的文庫篩選。

※ 其中文庫質粒可以使用***轉的方法進行文庫篩選,酵母細胞文庫甘油菌可以使用maiting的方法進行文庫篩選,根據老師的實驗習慣可以自由選擇,結果沒有任何差異的。

9.3.如何檢測文庫質量?

※ 對於文庫的質量,壹個簡單的金標準就是,樣本內的所有基因都在文庫裏,且基因要有壹半以上的全長基因,這個文庫就是合格的。

※ 對於文庫的檢測,可以針對我們交付的產品,做以下幾個方面的檢測:

根據老師的樣本信息,選擇3-5個低拷貝的基因,設計合成引物,以我們提供的文庫質粒為模板,進行PCR擴增,如果低拷貝的基因都能擴增出來,高拷貝的就不會丟失,文庫質量即可以判斷為合格。

※ 對於我們提供的大腸桿菌文庫甘油菌,可以進行梯度稀釋後鋪板培養,第二天計算庫容量,同時挑取單克隆進行PCR擴增和測序檢測,以判斷插入片段長度和空載率。

9.4.如何評價文庫質量?

※ 文庫質量的關鍵指標,主要是文庫庫容、空載率及插入片段平均長度。

※ 文庫的原始庫容肯定是越高越好,我們公司承諾的是大於1*10^7的庫容量,這個是原始庫容量,也就是沒有經過任何擴增過程,直接轉化出來的庫容量。比其他公司承諾的1*10^6的庫容量要高10倍以上,下面詳細解釋下庫容量的高低對文庫質量的影響:

※ 生物樣本,除了低等生物,目前研究比較多的物種,比如人,大鼠,小鼠,其基因數在5*10^4左右,文庫至少得100倍覆蓋,也就是庫容至少需要5*10^6以上。

※ 對於植物樣本,其基因數量比人的大很多,比如水稻樣本,其基因數量為人的2-3倍,小麥樣本,其基因數量為人的5-6倍,這樣就需要更多的文庫庫容量。對於水稻樣本,需要覆蓋100倍的基因數,要求的文庫原始庫容量是大於1*10^7以上。市場上別的公司提供的文庫最多只能覆蓋10倍左右,這麽低的覆蓋度,必然造成大量基因的丟失。

※ 對於有的公司宣傳的,庫容量不是越高越好,這絕對是不負責任的忽悠,為自己的文庫質量不合格找不合理的借口。

※ 對於插入基因長度,別的公司壹般平均長度就在800bp左右,我們公司可以承諾做到1200bp以上,這個差距是巨大的,下面再 詳細介紹下插入片段長度對文庫質量的影響:

※ 壹般的壹個功能基因,其壹般長度會在200個氨基酸以上,也就是編碼區在600bp堿基以上,裝入文庫的基因,除了編碼區,還會有5’UTR區,3‘UTR區以及polyA區域,這幾個部分加起來,基因的長度壹般至少會在1000bp以上。由於文庫是個混合物,會存在競爭性抑制,短的基因過多,勢必會影響長度基因的比例,以及長的基因的表達豐度。

※ 我們的文庫產品,插入片段平均長度會在1200bp以上,最短的會在1000bp左右。對於文庫篩選,不是說只要有基因的壹個片段就可以了,蛋白質的功能需要多種因素的參與,如果插入基因過短,篩選到的結果只是壹個基因片段,甚至是靠近polyA的壹小段基因,這個結果的可行度在哪裏?基本都可以認為是假陽性的結果的。

※ 對於有些公司宣稱的,文庫的基因插入片段不是越長越好,其實是對客戶的極其不負責任和不合理的忽悠,只是因為自己沒有技術做到更長的片段長度,而找的理由。

9.5. Mating和***轉兩種篩庫方法哪種好?

***轉和maiting兩種方法,結果是壹樣的,只是壹個文庫質粒轉到酵母細胞的方法,對於後續的文庫篩選沒有任何區別的,可以根據老師的實驗習慣,自由選擇的。

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