在植物表達載體中構建特定的外源基因，並將其轉入受體植物中，並不是植物遺傳轉化的最終目的。理想的轉基因植物通常需要外源基因在特定部位和特定時間內高水平表達，以產生理想的表型性狀。然而，近二十年的發展歷史表明，外源基因經常出現在受體植物中，如表達效率低、表達產物不穩定甚至基因失活或沈默，導致轉基因植物無法投入實際應用。此外，轉基因植物的安全性在許多國家引起了人們的關註，例如轉基因可能會隨花粉傳播，抗生素篩選標記基因可能會使壹些臨床抗生素失效。上述問題的出現，使得高科技植物基因工程處於前所未有的困境時期。為了解決這些問題，近年來，人們對植物轉基因技術進行了多方面的探索和改進，植物表達載體的改進和優化是其中最重要的內容之壹。本文總結了已經取得的進展。
1啟動子的選擇和轉化
外源基因表達不足往往是得不到理想轉基因植株的重要原因。因為啟動子在決定基因表達中起著關鍵作用，所以首先要考慮的是選擇合適的植物啟動子並提高其活性。
目前，植物表達載體中廣泛使用的啟動子是組成型啟動子。例如，大多數雙子葉轉基因植物使用CaMV35S啟動子，而單子葉轉基因植物主要使用來自玉米的泛素啟動子和來自水稻的Actinl啟動子。在這些組成型表達啟動子的控制下，外源基因將在轉基因植物的所有部分和所有發育階段表達。然而，外源基因在受體植物中的持續高效表達不僅造成浪費，而且往往會引起植物的形態變化，影響植物的生長發育。為了使外源基因在植物中發揮有效作用，減少對植物的不利影響，人們越來越重視特異表達啟動子的研究和應用。已發現的特異性啟動子主要包括器官特異性啟動子和誘導特異性啟動子。比如種子特異性啟動子、果實特異性啟動子、葉肉細胞特異性啟動子、根特異性啟動子、傷害誘導啟動子、化學誘導啟動子、光誘導啟動子、熱激誘導啟動子等等。這些特異啟動子的克隆和應用為外源基因在植物中的特異表達奠定了基礎。例如，瑞士CIBA-蓋基公司利用PR-IA啟動子控制轉基因煙草中Bt毒素基因的表達。由於啟動子可以被水楊酸及其衍生物誘導，所以在害蟲復發的季節，通過噴灑廉價、無汙染的化學物質來誘導抗蟲基因的表達，顯然是壹種非常有效的方法。
在植物轉基因的研究中，利用天然啟動子往往無法獲得滿意的結果，特別是在進行特異性表達和誘導表達時，表達水平大多不理想。改造現有啟動子，構建復合啟動子將是壹條非常重要的途徑。例如，Ni等將章魚堿合成酶基因啟動子的轉錄激活區與甘露堿合成酶基因啟動子結合，GUS表達結果顯示，修飾後的啟動子活性明顯高於35S啟動子。吳瑞等將誘導型PI-II基因啟動子與水稻Actinl基因內含子1結合，新啟動子的表達活性提高了近10倍(專利)。這些人工啟動子在植物基因工程研究中發揮了重要作用。
2.提高翻譯效率
為了增強外源基因的翻譯效率，在構建載體時壹般需要對基因進行修飾，主要考慮三個方面:
2.1添加5’-3’-非翻譯序列
許多實驗發現，真核基因的5’-3’-非翻譯序列(UTR)對於基因的正常表達是非常必要的，該片段的缺失往往會導致mRNA穩定性和翻譯水平的顯著下降。如煙草花葉病毒(TMV)126 kda蛋白基因翻譯起始位點上遊有壹個由68bp核苷酸組成的ω元件，為核糖體提供了壹個新的結合位點，可將Gus基因的翻譯活性提高數倍。目前，許多載體在外源基因的5’-末端添加了ω翻譯增強序列。Ingelbrecht等人研究了各種基因的3’-末端序列，發現章魚堿合成酶基因的3’-末端序列可以使NPTII基因的瞬時表達提高20倍以上。此外，不同基因的3’-末端序列在促進基因表達方面具有不同的效率。例如，RBC的3’-末端序列對基因表達的促進作用比查爾酮合酶基因的3’-末端序列高60倍。
2.2圍繞初始密碼優化序列
雖然起始密碼子在生物學中是普遍存在的，但不同生物來源的基因在起始密碼子周圍都有自己特殊的序列。比如植物起始密碼子周邊序列的典型特征是AACCAUGC，動物起始密碼子周邊序列是CACCAUG，原核起始密碼子周邊序列與它們有很大的不同。科薩克詳細研究了起始密碼子ATG周圍堿基的定點突變對轉錄和翻譯的影響，得出結論:在真核生物中，起始密碼子周圍的序列為ACCATGG時轉錄和翻譯效率最高，尤其是-3位的A對翻譯效率非常重要。這個序列後來被稱為科薩克序列，並被用於表達載體的構建。比如有壹個細菌的幾丁質酶基因，它最初的初始編碼序列是UUUAUGG。當將其改造為ACCAUGG時，其在煙草中的表達量增加了8倍。因此，在用非植物基因構建表達載體時，應根據植物起始密碼子周圍序列的特點進行改造。
2.3轉化基因編碼區。
如果外源基因來自原核生物，由於表達機制的差異，這些基因在植物中的表達水平往往很低。例如，來自蘇雲金芽孢桿菌的野生型殺蟲蛋白基因在植物中的表達水平很低，發現這是由於原核生物和植物基因的差異，導致mRNA穩定性下降。美國孟山都公司的Perlak等人在不改變毒蛋白氨基酸序列的情況下，對殺蟲蛋白基因進行了改造，選擇了植物偏愛的密碼子，增加了GC含量，去除了原有序列下影響mRNA穩定性的元素。結果表明，毒蛋白在轉基因植株中的表達量提高了30 ~ 100倍，獲得了明顯的抗蟲效果。
3消除位置效應
當外源基因轉入受體植物時，其在不同轉基因植物中的表達水平往往差異很大。這主要是由於外源基因在受體植物基因組中的插入位點不同。這就是所謂的“位置效應”。為了消除位置效應，將所有外源基因整合到植物基因組的轉錄活性區，目前的表達載體構建策略中通常考慮應用核基質結合區和定點整合技術。
基質結合區(Matrix association region，MAR)是壹種存在於真核細胞染色質中的DNA序列，特異性結合核基質。壹般認為，MAR序列位於活性轉錄DNA環狀結構的邊界，其功能是制造壹種分割效應，使各轉錄單位保持相對獨立，不受周圍染色質的影響。相關研究表明，將MAR置於目的基因的兩側，構建含有MAR-gene-MAR結構的植物表達載體進行遺傳轉化，可以顯著提高目的基因的表達水平，降低不同轉基因植物間目的基因表達水平的差異，減少位置效應。例如，Allen等人研究了異源MAR(來自酵母)和同源MAR(來自煙草)對煙草中Gus基因表達的影響，發現酵母的MAR可以使轉基因的表達水平平均提高12倍，而煙草本身的MAR可以使轉基因的表達水平平均提高60倍。來源於雞溶菌酶基因的MAR也能發揮同樣的作用。
另壹個可行的方法是采用面向站點的集成技術。這項技術的主要原理是，當轉化載體含有與宿主染色體同源的DNA片段時，外源基因可以通過同源重組整合到染色體的特定位點。在實際應用中，首先要分離染色體轉錄活性區的DNA片段，然後再構建植物表達載體。在微生物的基因操作中，同源重組定點整合已成為常規技術，外源基因的定點整合在動物中已獲得成功，但在植物中，除葉綠體表達載體外，鮮有核轉化成功的報道。
4.葉綠體表達載體的構建
為了克服外源基因表達效率低、核基因隨花粉擴散帶來的位置效應和不安全性等問題，近年來出現的壹種新的遺傳轉化技術——葉綠體轉化，以其優勢和發展前景日益受到人們的認可和重視。到目前為止，已經在煙草、水稻、擬南芥、馬鈴薯和油菜五種植物中實現了葉綠體轉化(侯炳凱等發表)，這使得該轉化技術成為植物基因工程中新的增長點。
目前，許多植物葉綠體基因組的全序列已經確定，這為通過同源重組機制將外源基因定點整合到葉綠體基因組中奠定了基礎。目前構建的葉綠體表達載體基本上都是定點整合載體。構建的葉綠體表達載體基本屬於定點案例載體。構建葉綠體表達載體時，通常在外源基因表達盒的兩側連接壹段葉綠體DNA序列，稱為同源重組片段或打靶片段。當載體導入葉綠體時，通過這兩個片段與葉綠體基因組上相同的片段進行同源重組，就有可能將外源基因整合到葉綠體基因組的特定位點。在用於作物改良的葉綠體轉化中，要求同源重組後，外源基因的插入不會造成葉綠體基因原有序列的丟失，也不會破壞原有基因在插入點的功能。為滿足這壹要求，選擇了兩個相鄰的基因作為同源重組片段，如rbcL/accD，16 strnv/rpsl2rps7，psba/trnk，rps7/ndhb。發生同源重組時，外源基因定點插入相鄰兩個基因的間隔區，保證了原基因的功能不受影響。最近，Daniel等人利用煙草葉綠體基因trnA和trnI作為同源重組片段構建了通用載體。由於trnA和trnI的DNA序列在高等植物中高度保守，作者認為該載體可用於許多不同植物的葉綠體轉化。如果該載體的通用性得到證實，這項工作無疑將為構建壹種方便實用的新型葉綠體表達載體提供壹個很好的思路。
由於葉綠體基因組的高拷貝，定點整合到葉綠體基因組中的外源基因往往能高效表達。例如，McBride等人首次將Bt CryIA(c)毒素基因轉入煙草葉綠體中，Bt毒素蛋白的表達量高達葉片總蛋白的3% ~ 5%，而通常的核轉化技術只能達到0.001% ~ 0.6%。最近Kota等將Bt Cry2Aa2蛋白基因轉入煙草葉綠體，也發現煙草葉片中毒性蛋白的表達量很高，占可溶性蛋白的2% ~ 3%，比核轉化高20 ~ 30倍。轉基因煙草不僅能抵抗敏感的昆蟲，還能殺死那些高抗性的昆蟲。Staub等人最近報道，轉入煙草葉綠體的人生長激素基因表達量高達葉片總蛋白的7%，比核轉化高300倍。這些實驗充分說明葉綠體表達載體的構建和轉化是實現外源基因高效表達的重要途徑之壹。
定位信號的應用
這些載體優化策略的主要目的是提高外源基因的轉錄和翻譯效率。但是，高水平表達的外源蛋白能否在植物細胞中穩定存在，積累多少，是植物遺傳轉化需要考慮的另壹個重要問題。
近年來研究發現，如果將某些外源基因與適當的定位信號序列連接，使其產生並轉運到細胞的特定部位，如葉綠體、內質網、液泡等，可以顯著提高外源蛋白的穩定性和積累。這是因為內質網等某些區域為壹些外源蛋白提供了相對穩定的內環境，有效阻止了外源蛋白的降解。例如，Wong等人將擬南芥rbcS亞基的轉運肽序列與殺蟲蛋白基因聯系起來，發現殺蟲蛋白可以在轉基因煙草的葉綠體中特異性積累，外源蛋白的總積累量比對照高10 ~ 20倍。最近，、宋、等。還將rbcS亞基的轉運肽序列與PHB合成相關基因相連，試圖使基因表達產物在轉基因油菜種子的質體中積累，從而增加外源蛋白的含量。此外，萬德爾特等人和斯豪滕等人將內質網定位序列(四肽KDEL的編碼序列)與外源蛋白基因聯系起來，發現轉基因植物中外源蛋白含量顯著提高。顯而易見，定位信號對蛋白質積累有積極的促進作用，但同壹定位信號是否適用於所有蛋白質還需進壹步確定。
內含子6在增強基因表達中的應用
內含子增強基因表達的作用最早是由Callis等在轉基因玉米中發現的，玉米醇脫氫酶基因(Adhl)的第壹個內含子(內含子1)顯著增強了外源基因的表達，該基因的其他內含子(如內含子8、內含子9)也在壹定程度上增強了外源基因的表達。後來Vasil等人還發現玉米果糖合成酶基因的第壹內含子可以使CAT的表達水平提高10倍。水稻肌動蛋白基因的第三內含子也能使報告基因的表達水平提高2 ~ 6倍。到目前為止，內含子增強基因表達的機制尚不清楚，但壹般認為內含子的存在可能會增強加工效率和mRNA的穩定性。Tanaka等人的許多研究表明，內含子對基因表達的增強作用主要發生在單子葉植物中，而在雙子葉植物中則沒有。
由於內含子可以增強基因表達，Mcelroy等人在構建單子葉植物表達載體時，特意將水稻肌動蛋白基因的第壹個內含子保留在基因啟動子的下遊。類似地，Christensen等人在構建載體以增強外源基因在單子葉植物中的表達時，將玉米泛素基因的第壹個內含子置於啟動子的下遊。但也有研究指出，特定內含子對基因表達的促進作用取決於啟動子強度、細胞類型、靶基因序列等多種因素，有時甚至取決於內含子在載體上的位置。例如，玉米Adhl基因的內含子9位於Gus基因的5’端，在CaMV35S啟動子的控制下，Gus基因的表達沒有增強。當內含子位於Gus基因的3-末端時，在相同啟動子的控制下，Gus基因的表達水平增加了約3倍。可見，內含子對基因表達的作用機制可能非常復雜，如何利用內含子構建高效的植物表達載體還缺乏固定的模式，值得進壹步探討。
7多基因策略
到目前為止，大多數遺傳轉化研究都是將單個外源基因轉入受體植物。但有時由於缺乏單壹的基因表達強度或單壹的作用機制，無法獲得理想的轉基因植株。如果將兩個或兩個以上的協同基因同時轉入植物，會比單個基因轉化獲得更好的結果。這壹策略已被應用於培育抗病蟲害的轉基因植物。例如，根據抗蟲基因的抗蟲譜和作用機制的不同，可以選擇兩種功能互補的基因進行載體構建，通過壹定的方式將兩種抗蟲基因同時轉入植物中。王偉等人將凝集素基因和蛋白酶抑制劑基因同時轉入棉花，獲得了含有二價抗蟲基因的轉化植株。Barton等人將Bt殺蟲蛋白基因和蠍毒素基因同時轉入煙草，大大提高了抗蟲性和防止害蟲產生抗性的能力(專利)。在抗病性方面，我們實驗室的藍海燕等人構建了含有β-1，3-葡聚糖酶基因和幾丁質酶基因的雙價植物表達載體，並將其導入油菜和棉花。結果表明，轉基因植株具有明顯的抗病性。最近，馮道榮、李寶健等人將兩三個抗真菌基因和hpt基因連接到壹個載體上，將兩個抗蟲基因和bar基因連接到另壹個載體上，用基因槍導入水稻植株。結果表明，70%的野生稻後代植株含有全部導入的外源基因(6 ~ 7個)，並且導入的外源基因傾向於整合在基因組的壹個或兩個位點上。
通常，常規轉化不能將大於25kb的外源DNA片段導入植物細胞。而壹些功能相關的基因，如植物中的數量性狀基因、抗病基因等，大多以“基因簇”的形式存在。如果將壹些大於100kb的DNA大片段，如植物染色體中天然存在的基因簇或壹系列不相關的外源基因導入植物基因組的同壹位點，將有可能出現多個基因控制的優良性狀或產生廣譜抗蟲和抗病，還會賦予受體細胞壹條全新的代謝途徑，產生新的生物分子。而且大基因組或基因簇的同步插入也可以在壹定程度上克服轉基因帶來的位置效應，減少基因沈默等不良現象的發生。最近，美國的Hamilton和中國的劉耀光開發了新壹代載體系統，即BIBAC和TAC，它們克隆了DNA的大片段，並在農桿菌的幫助下直接轉化到植物中。這兩種載體不僅可以加速基因的圖位克隆，而且對於多基因控制下的品種改良具有潛在的應用價值。目前，BIBAC和TAC載體在多基因轉化中的應用研究才剛剛開始。
8篩選標記基因的利用和缺失
篩選標記基因是指在遺傳轉化中，能使轉化細胞(或個體)從許多非轉化細胞中篩選出來的標記基因。它們通常能使轉基因細胞產生對某種選擇劑有抗性的產物，使轉基因細胞在添加了這種選擇劑的培養基上正常生長，而非轉基因細胞由於缺乏抗性而對這種選擇劑表現出敏感性，不能生長、發育和分化。構建載體時，篩選標記基因連接在目的基因的壹側，每個基因都有自己的基因調控序列(如啟動子、終止子等。).目前常用的篩選標記基因主要有兩類:抗生素抗性酶基因和除草劑抗性酶基因。前者可對某些抗生素產生耐藥性，後者可對除草劑產生耐藥性。最常用的抗生素抗性酶基因有NPTII基因(產生新黴素磷酸轉移酶，抗性卡那黴素)、HPT基因(產生潮黴素磷酸轉移酶，抗性潮黴素)和Gent基因(抗性慶大黴素)。常用的抗除草劑基因有EPSP基因(產生5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶，抗草甘膦)、GOX基因(產生草甘膦氧化酶，降解草甘膦)、bar基因(產生PPT乙酰轉移酶，抗雙丙氨膦或草銨膦)等。
以上，1，2，3，5，6都是值得註意的，尤其是5，因為妳想把它分泌到細胞外。骨架向量可以是PB I121，然後妳可以在上面改變基因型。
接下來就是克隆的步驟，相對簡單。
1首先獲得目的基因的酶切位點，並將其連接到改造後的載體中。
2.將質粒轉移到大腸桿菌DH5a中進行擴增。
3.將擴增的質粒轉入植物細胞中進行表達。
4.收集根的細胞外培養基檢測蛋白的表達和分泌。
至於改造載體的步驟，回答問題的話就簡單說說吧。畢竟如果妳真的做好了載體，妳就可以自己開公司了。