精制液體糖化酶的開發
曾新民劉璋鐘敏
根據糖化酶發酵成熟醪轉化率高的特點，對生產液體酶的絮凝劑和絮凝方法進行了篩選和研究，形成了適合工業化生產的獨特絮凝工藝。采用先進的板框預塗工藝和超濾膜濃縮分離技術，高效回收產品。單罐回收率達到80%，綜合平均回收率達到75%以上，比傳統鹽析工藝提高7個百分點。
糖化酶；絮凝回收率
通常，在發酵工業中，人們往往註重提高菌種的發酵活性而忽視提高產品的回收率，結果是產量高而收成不好。本研究采用獨特的絮凝工藝，通過板框預塗和超濾膜濃縮生產精制液體糖化酶，提高了產品質量等級(從工業級到食品級)，減少了濾液對環境的汙染。與傳統鹽析工藝相比，平均回收率提高了7%，綜合平均回收率達75%以上。產品各項技術指標完全符合QB1805.2-93《工業糖化酶制劑》標準，3個月內酶活保存率大於95%。
1材料和設備
(1)絮凝劑:APAM、苯甲酸鈉、矽藻土、硫酸鋅、黃血鹽等。
(2)防腐劑:醋酸鈣、青黴素、山梨酸鉀、苯甲酸鈉等。
(3)絮凝池:V=20 m3，轉速:50 ~ 70 r/min。
(4)聚丙烯板框壓濾機:60 m2。
(5)濾布清洗機。
(6)預塗槽:V=3 m3，轉速:80 r/min。
(7)進口UF809卷式膜超濾機。
(8)儲罐:V=20 m3。
(9)成品處理罐:V=3 m3，轉速:50 r/min。
精制濃縮液體糖化酶提取工藝的研究
2.1工藝路線確定
這個過程的核心是濃縮方法的選擇和絮凝工藝的確定。目前國內同類產品有兩種濃縮方式。壹種是依靠熱源蒸發產品中的水分；另壹種是用滲透膜超濾除去產品中的水分。比較以上兩種方法，前者設備投資大，能耗大；後者具有投資少、能耗低、操作簡單、清洗方便、維護和更換費用低、產品收率高等優點。因此，我們選擇了先進的滲透膜超濾濃縮方法。絮凝過程是萃取過程中最關鍵的壹步，它直接決定了板框過濾的工作和產品的質量。近年來，絮凝技術的研究主要集中在絮凝劑的選擇上。根據實際情況，我們選擇了幾乎不含無機金屬離子的絮凝劑和高效的過濾方法。
2.2工藝流程
酶發酵液→絮凝→板框壓濾→過濾。
↓ ↓
濾餅超濾濃縮
↓ ↓
幹燥後作為填料或飼料進行防腐和標準化處理。
↓
最後結果
2.3酶發酵液的質量
酶發酵液的質量直接決定了產品的質量和產量。我們制定的發酵液質量指標見表1。
表1酶發酵液質量指標
顯微鏡檢查項目顯示酶活性的pH DE值(U/mL)。
顯微鏡檢查指標正常。
無雜菌> 2.5× 104 4.2 ~ 4.6 < 10
對個別批次發酵液達不到上述要求的，全部改為生產固體粉末。
2.4絮凝過程的研究
絮凝過程是精制濃縮液體糖化酶生產中最關鍵的步驟。如果絮凝效果不好，會導致處理時間長，增加細菌汙染的可能性。
采用絮凝工藝對發酵液進行預處理，可以去除發酵液中的細菌和其他不溶性顆粒，從而大大提高發酵液的過濾性和澄清度。絮凝的機理有以下解釋:
絮凝劑(1)中和懸浮顆粒表面的電荷(細菌細胞表面也存在羧基和氨基，所以帶電荷)，最終導致這些顆粒的絮凝。
(2)絮凝劑的包埋或吸附是機械吸附包埋細菌等不溶性顆粒。
2.4.1小規模絮凝對比試驗
取100 ml樣品按以下絮凝方法進行絮凝，然後用內襯漏鬥的濾紙在常壓下過濾。
方法1:取原樣品，直接用濾紙過濾。
方法二:加入1/3水，1%麩皮，2%矽藻土。
方法三:加水1/3和適量APAM。
方法四:加入30% ~ 40%的水、膨潤土、矽藻土、苯甲酸鈉和APAM。
方法五:加入1/3水和1%鋸末，依次加入適量硫酸鋅、黃血鹽和APAM。結果如表2所示。
從表2可以看出，方法4和方法5是最理想的絮凝方法，濾液清澈透明，過濾速度快，濾餅水分少，可以應用於大規模生產。方法4更符合食品衛生標準。方法1，2，3都不同程度的存在問題，應該淘汰。
表2絮凝法測試結果
方法對過濾速度(s/10滴)結果進行分析。
1 40深紅棕色半透明濾餅擠壓前未分離，成糊狀。難以過濾，不采用此方法。
2 14淡黃色亮度不夠，擠壓前濾餅變松，分離良好。用紗布擠壓濾餅，濾餅變成塊狀，容易擠出來，水分很少。容易過濾，加快過濾速度後可以采用這種方法。
淡黃色清液透明不擠出前濾紙上無糊，外觀分離程度不如方法2。用紗布擠壓濾餅，較硬，含有大量水分，濾餅變成軟團。過濾效果好，但濾餅難擠出，不松散，濾餅水分多。
4-6淺黃色澄清液體透明濾餅在擠出前變得松散並很好地分離。用紗布擠壓濾餅，濾餅變成塊狀，容易擠出來，水分很少。應該采用更好的過濾方法。
5 7淡黃色澄清液體澄清透明，同4。
應該采用更好的過濾方法。
2.4.2工業生產
在小試的基礎上，我們采用四種方法對四批發酵液(按6m3發酵液用量計算)進行了工業絮凝過濾處理。
方法1:發酵液不經任何處理直接過濾。
方法二:加入1%鋸末和2%矽藻土，過濾。
方法三:加入1/3純凈水和1%鋸末，然後依次加入適量硫酸鋅、黃血鹽和APAM，過濾。
方法四:加入1/3純凈水、1%矽藻土、適量膨潤土、苯甲酸鈉和APAM。加入絮凝劑，攪拌30分鐘(轉速50 ~ 80 r/min)，過濾。結果如表3所示。
從表3可以看出，方法1和方法2處理時間長，濾液不如後兩種清澈，濾餅含水量高。方法3和方法4的處理效果基本相同，但考慮到方法3的濾液中含有黃血鹽等。
表3絮凝法工業試驗結果
項目方法1
9602018批次方法2
9602007批次方法3
9603001批次方法4
9602025批次
釋放can的酶活(U/mL)為28 466 30 428 29 265 438+04 29 065 438+08。
絮凝後，直接觀察到它是稀的，有點粘，有粗顆粒和明顯的絮狀物，如方法3。
過濾時間(小時)22 16 6 5
濾液的酶活性(u/ml) 22 772 23 646 24 540 24 566
濾餅的酶活性(u/g) 7 759 6 432 5 648 5 489
濾餅水分(%) 62 58 53 52
濾液的顏色為棕紅色、亮棕紅色、亮淺棕紅色和亮淺棕紅色。
濾液體積(m3) 5.2 6.2 5.7 5.7
成品體積(m3)為1.001.101.21.1.20。
成品酶活(U/mL)為104 170 106 437 105 448 104 766。
成品感官鑒定為棕色、粘棕色、微粘棕色、微粘棕色、微粘棕色。
化合物可能會影響成品的質量，所以我們選擇方法4進行生產。
在絮凝處理的實驗研究和工藝運行中，我們的經驗是:
(1)絮凝劑的使用效果與多種因素有關，其中最重要的是絮凝劑的濃度、攪拌速度和攪拌時間。
(2)當絮凝劑用量從零開始增加時，絮凝的懸浮顆粒量相應增加，但超過壹定濃度後，絮凝顆粒又重新分散。因此，有必要通過實驗來確定絮凝劑的最佳添加量。
(3)加入的絮凝劑與懸浮液中的顆粒接觸是絮凝的先決條件，所以需要攪拌。但產生的絮體非常脆弱，過度攪拌會使絮體破碎的傾向大於絮體形成的傾向，所以要控制好攪拌速度和時間。根據實際生產情況，采用攪拌30 min，轉速50 ~ 80 r/min的操作，取得了良好的絮凝效果。
2.5板框過濾工藝的工藝操作
液體酶的生產需要濾液，因此濾液的濁度直接影響液體酶的質量和超濾設備的使用。剛開始投料時，因為濾布比較幹凈，所以要靠罐內的壓差自然投料。如果開始時給料加壓，濾液會渾濁。壹段時間後，當濾液清澈且過濾速度恒定時，緩慢加壓進料。這裏特別強調的是，板框接收池的排水口要有壹個裝置，使濁液回流到絮凝池。壹旦發現濾液渾濁，可及時退回。每批過濾後，濾布都要清洗幹凈，擺放整齊，以備下次使用。
板框過濾後的濾餅由各廠家根據實際情況進行處理。因為我們廠也生產固體酶，在它的生產過程中，有些填料需要標準化，所以我們把濾餅烘幹，做成填料。幹品中有2萬多個單位的酶活性，所以這種處理是比較理想的。
2.6超濾濃縮工藝研究
超濾是壹種壓力膜過濾方法，其工作原理是在壹定壓力下，將大的溶質分子保持在膜的壹側(原液中)；而小的溶質分子滲透到膜的另壹側，從而達到分離、純化和濃縮產品的目的。超濾適用於生物大分子(如糖化酶和α-澱粉酶)發酵產物的提取、純化和濃縮。該工藝成本低，操作方便，條件溫和，酶活保持性好，產品回收率高。
我們選用進口UF809卷式超濾膜，根據產品質量和工藝要求，以每組3臺，3臺並聯的形式安裝超濾機。超濾器入口壓力約為4×9.8×104 Pa，出口壓力約為2 ~ 4× 9.8× 104 Pa，進出口壓差約為1×9.8×104 Pa。工作溫度低於40℃。酶溶液的濃縮倍數視需要而定，壹般為4 ~ 5倍左右。在運行過程中，定期測量超濾液的流速和酶活性，以確認超濾器是否正常運行。超濾濃縮的結果如表4所示。
表4超濾濃度統計結果
批評
1號發酵液
酶活性
發酵(單位/毫升)
液體體積
濾液(立方米)
卷
超濾(立方米)
時間
(h)超濾、濃縮和收縮果實。
發酵液體
屈服系數
(%)
成品酶
活力
成品(單位/毫升)
卷
濃度(立方米)
多個的
濃度
多個的
酶活性
屈服系數
(%)
9507-01 29 871 8 5.8 2.5 120 301 1.54 3.76 4.00 98 77.5
9507-02 27 232 8 6.0 2.3 110 380 1.50 4.00 4.05 97 76.0
9503-04 28 431 8 6.1 2.2 115 182 1.56 3.80 4.05 97 79.0
9508-10 30 781 8 5.5 2.0 123 124 1.60 3.44 4.00 98 80.0
9509-07 31 232 8 6.0 2.1 128 429 1.50 4.00 4.10 99 77.0
9509-09 30 231 8 5.9 2.0 111 718 1.60 3.70 3.75 98 75.0
從表4可以看出，處理8t清液大約需要2.3 h，濃縮酶的總收率在75%以上。
2.7精制濃縮液酶保存實驗
將濃縮酶(654.38+100，000 u/ml)在室溫下儲存3個月後，測定酶活性的存活率。結果如表5所示。
表5精制濃縮液酶保存實驗
防腐劑添加量(%)殘留酶活性(%)
壹個星期不加，會發黴，有臭味。
醋酸鈣0.1，青黴素1.8萬單位/m3 97。
0.2的苯甲酸鈉和65438的青黴素+80萬單位/m3 96。
苯甲酸鈉0.2，山梨酸鉀0.1.98。
從表5可以看出，三個月酶活保存率高於95%。山梨酸鉀和苯甲酸鈉組成的防腐劑，酶活存活率達98%，是上述三種防腐劑中最理想的，適合工業化生產。
作者:曾新民張三門峽發酵廠，盧氏，472200。
劉河南省科學院生物研究所，鄭州，450008。
參考
[1]張淑錚編輯。酶制劑行業。北京:科學出版社，1984
[2]曹又聲和劉。現代工業微生物學。長沙:湖南科學技術出版社，1998。