當時對PCR的影響壹般，但操作上沒有問題。但仔細想想，和其他實驗壹樣，我的知識很少，PCR也是如此。所以我覺得有必要重新學習PCR相關的各種技術和原理。
進入正題
PCR(聚合酶鏈式反應)聚合酶鏈式反應又稱體外DNA擴增技術，由美國塞特斯公司的Kary Mullis於1985年首創，可將少量DNA片段擴增壹百萬倍以上。Kary Mullis本人獲得了1993諾貝爾化學獎。
前面分享過PCR的歌，在這裏先回顧壹下，再系統整理PCR的相關知識。
壹、PCR的原理
在DNA聚合酶的催化下，以母DNA為模板，以特異性引物為延伸起點。通過變性、退火、延伸等步驟，在體外復制與母模板DNA互補的子DNA的過程。
聚合酶鏈式反應用於擴增已知的短DNA片段，該片段可以是單個基因或只是基因的壹部分。與生命體不同，PCR只能復制非常短的DNA片段，通常不超過10kbp。DNA是雙鏈分子，所以它的大小是用互補DNA雙鏈的結構單位(核苷酸)來衡量的，單位是堿基對，bp)。
二、PCR反應組分
模板
太多:
非特異性條帶增多。
太少:
PCR的產量下降。
底漆
預擴增核酸片段兩端的已知序列決定了特異性。
高:
非特異性產物的擴增和錯配增加了引物間引物二聚體的形成，產量下降。
低:
產量減少。
聚合酶
高耐熱性
高:
引物非特異性產物的擴增。
低:
產品的數量減少。
dNTP
dATP、dGTP、dCTP、dTTP
太高:
加快反應速度也會增加堿基的錯誤摻入率和實驗室檢測的成本。
太低:
反應速度的降低可以提高實驗的準確性。
緩沖器
鎂離子
Taq酶是Mg2+依賴性的，這顯著影響反應的特異性和擴增片段的產量。
超額:
會增加非特異性擴增並影響產量。
太低:
酶活性顯著降低。
10~50毫米Tris- Cl (pH8.4)
維持Taq酶的堿性環境。
25~50毫米KCl
促進引物退火，> > 50 mM會抑制Taq酶活性。
100微克/毫升牛血清白蛋白(BSA)
它對酶有壹定的保護作用，如果質量不好，會起到反作用。建議使用乙酰化BSA。明膠、吐溫-20和二硫蘇糖醇(DTT)具有類似的效果。
三、PCR反應的基本步驟
壹般的聚合酶鏈式反應由20至35個循環組成，每個循環包括以下三個步驟:
變性:
退火或連接:
分機(分機):
4.PCR反應條件的優化
1，變性溫度和時間:
保證模板DNA的熔化是保證整個PCR擴增成功的關鍵。
當在90 ~ 95℃加熱30 ~ 60秒時，即使是最復雜的DNA分子也會變成單鏈。
過高的溫度或持續時間過長的高溫會破壞Taq酶活性和dNTP分子。
2.復性溫度和時間:
PCR擴增的特異性取決於復性過程中引物和模板的組合。
復性溫度越高，產物特異性越高。復性溫度越低，產物特異性越低。
需要根據底漆的Tm值來設定。
3.延伸溫度和時間:
壹般Taq酶的最適溫度在70 ~ 75℃之間，當引物小於16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利於引物與模板的結合，可將溫度慢慢提高到70 ~ 75℃。
延伸反應時間可取決於待擴增片段的長度，小於1 KB和1 min就足夠了。如果大於1kb，延長時間要延長。Taq酶可以按照1kb/min增加時間。
這裏需要註意的是，如果延伸時間過長，可能會出現非特異性擴增。因此，有必要設定壹個合適的延長時間。
4.循環次數:
在選擇了其他參數之後，PCR循環的次數主要取決於模板DNA的濃度。
理論上20？25個循環後，PCR產物的積累可達到最大值。在實際操作中，每次反應的產率不可能達到100%，所以無論模板濃度是多少，20~30次循環都是比較合理的循環次數。循環次數越多，非特異性擴增越多。
動詞 （verb的縮寫）PCR延伸技術
從PCR延伸出來的技術有很多，這裏只列舉幾個日常實驗中常用的。
1 .觸地PCR
登陸PCR主要用於優化PCR的條件。很多情況下，引物的設計給PCR帶來困難，比如特異性不夠，容易錯配。如果退火溫度太高，PCR效率會太低，但如果退火溫度太低，非特異性擴增會太高。
因此，先前循環的初始退火溫度被設定為比引物的最高熔化溫度(Tm)高幾度。在最初的幾個循環中，溫度逐漸下降到設定的最終Tm。在較高溫度下獲得高特異性匹配的模板後，在較低溫度下高效擴增。
2.逆轉錄聚合酶鏈反應
逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)的原理是從組織或細胞中提取總mRNA，用逆轉錄酶用Oligo(dT)或隨機引物將其逆轉錄成cDNA。然後使用cDNA作為模板進行PCR擴增，以獲得目的基因或檢測基因表達。
3 .實時PCR/定量PCR
實時熒光定量PCR技術是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR過程，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
4 .巢式PCR
首先，使用低特異性引物進行幾個循環以增加模板的數量，然後使用高特異性引物進行擴增。
5.SOE PCR
重疊延伸PCR分為重疊延伸PCR定點突變和重疊延伸PCR序列缺失突變兩種，即重疊延伸PCR基因拼接(SOE PCR)。
5.1重疊延伸PCR定點突變(因為原理簡單，直接上圖)。
這壹步壹定要用Pfu酶，不能用Taq酶，因為Taq酶容易在PCR產物的末端加壹個A，會造成產物的移碼突變。
5.2通過重疊延伸PCR的序列缺失突變
6.高GC含量PCR
具有高GC含量(>:65%)，由於G和C堿基之間的強氫鍵，DNA模板難以擴增。富含GC的序列也包括二級結構。因此，富含GC的序列會導致DNA聚合酶沿著模板“堵塞”，幹擾DNA合成。
為了擴增高GC含量的片段，必須解離雙鏈模板，這樣引物才能與模板結合，DNA聚合酶才能讀取序列。為了克服強烈的GC相互作用，最常見的方法是使用PCR添加劑如DMSO或輔助溶劑來幫助DNA變性。但這些試劑通常會降低引物的Tm，因此需要相應調整退火溫度。
高合成能力的DNA聚合酶由於與模板的結合能力更強，有利於完成高GC含量的PCR。超高熱穩定性DNA聚合酶也有利於高GC含量的PCR，因為更高的變性溫度(例如用98℃代替95℃)可能促進雙鏈解離和PCR擴增。
7.AS-PCR
PCR(等位基因特異性PCR (AS-PCR)是指引物與模板的堿基錯配可以有效抑制PCR反應，從而達到模板鑒別(等位基因鑒別)的目的。
因為在PCR中引物延伸從3’端開始，所以3’端的堿基對於引物延伸非常重要。如果這個堿基與模板互補，引物就可以連續延伸，PCR就可以正常進行，得到特定長度的擴增帶，否則就無法延伸。因此，只要將不同於正常等位基因的突變堿基排列在引物3’的末端，當含有突變序列的引物用於PCR時，如果獲得特異性條帶，則表明被測基因含有該突變。沒有出現特定的擴增帶，說明沒有這種突變。
註意:因為這裏只使用了引物3’末端的堿基錯配，所以需要找到合適的Tm才能達到檢測目的。
參考
Mullis，Kary B .等人“擴增、檢測和/或克隆核酸序列的方法”美國專利4，683，195。