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對基礎實驗的再認識(五)——PCR相關性

最早接觸PCR是在做科技創新和本科畢業論文相關實驗時,擴增野生型菌株和突變型菌株的壹個基因,然後用AS-PCR法設置溫度梯度,篩選出壹對能區分S和M菌株的特異性引物。

當時對PCR的影響壹般,但操作上沒有問題。但仔細想想,和其他實驗壹樣,我的知識很少,PCR也是如此。所以我覺得有必要重新學習PCR相關的各種技術和原理。

進入正題

PCR(聚合酶鏈式反應)聚合酶鏈式反應又稱體外DNA擴增技術,由美國塞特斯公司的Kary Mullis於1985年首創,可將少量DNA片段擴增壹百萬倍以上。Kary Mullis本人獲得了1993諾貝爾化學獎。

前面分享過PCR的歌,在這裏先回顧壹下,再系統整理PCR的相關知識。

壹、PCR的原理

在DNA聚合酶的催化下,以母DNA為模板,以特異性引物為延伸起點。通過變性、退火、延伸等步驟,在體外復制與母模板DNA互補的子DNA的過程。

聚合酶鏈式反應用於擴增已知的短DNA片段,該片段可以是單個基因或只是基因的壹部分。與生命體不同,PCR只能復制非常短的DNA片段,通常不超過10kbp。DNA是雙鏈分子,所以它的大小是用互補DNA雙鏈的結構單位(核苷酸)來衡量的,單位是堿基對,bp)。

二、PCR反應組分

模板

太多:

非特異性條帶增多。

太少:

PCR的產量下降。

底漆

預擴增核酸片段兩端的已知序列決定了特異性。

高:

非特異性產物的擴增和錯配增加了引物間引物二聚體的形成,產量下降。

低:

產量減少。

聚合酶

高耐熱性

高:

引物非特異性產物的擴增。

低:

產品的數量減少。

dNTP

dATP、dGTP、dCTP、dTTP

太高:

加快反應速度也會增加堿基的錯誤摻入率和實驗室檢測的成本。

太低:

反應速度的降低可以提高實驗的準確性。

緩沖器

鎂離子

Taq酶是Mg2+依賴性的,這顯著影響反應的特異性和擴增片段的產量。

超額:

會增加非特異性擴增並影響產量。

太低:

酶活性顯著降低。

10~50毫米Tris- Cl (pH8.4)

維持Taq酶的堿性環境。

25~50毫米KCl

促進引物退火,> > 50 mM會抑制Taq酶活性。

100微克/毫升牛血清白蛋白(BSA)

它對酶有壹定的保護作用,如果質量不好,會起到反作用。建議使用乙酰化BSA。明膠、吐溫-20和二硫蘇糖醇(DTT)具有類似的效果。

三、PCR反應的基本步驟

壹般的聚合酶鏈式反應由20至35個循環組成,每個循環包括以下三個步驟:

變性:

退火或連接:

分機(分機):

4.PCR反應條件的優化

1,變性溫度和時間:

保證模板DNA的熔化是保證整個PCR擴增成功的關鍵。

當在90 ~ 95℃加熱30 ~ 60秒時,即使是最復雜的DNA分子也會變成單鏈。

過高的溫度或持續時間過長的高溫會破壞Taq酶活性和dNTP分子。

2.復性溫度和時間:

PCR擴增的特異性取決於復性過程中引物和模板的組合。

復性溫度越高,產物特異性越高。復性溫度越低,產物特異性越低。

需要根據底漆的Tm值來設定。

3.延伸溫度和時間:

壹般Taq酶的最適溫度在70 ~ 75℃之間,當引物小於16個核苷酸時,過高的延伸溫度不利於引物與模板的結合,可將溫度慢慢提高到70 ~ 75℃。

延伸反應時間可取決於待擴增片段的長度,小於1 KB和1 min就足夠了。如果大於1kb,延長時間要延長。Taq酶可以按照1kb/min增加時間。

這裏需要註意的是,如果延伸時間過長,可能會出現非特異性擴增。因此,有必要設定壹個合適的延長時間。

4.循環次數:

在選擇了其他參數之後,PCR循環的次數主要取決於模板DNA的濃度。

理論上20?25個循環後,PCR產物的積累可達到最大值。在實際操作中,每次反應的產率不可能達到100%,所以無論模板濃度是多少,20~30次循環都是比較合理的循環次數。循環次數越多,非特異性擴增越多。

動詞 (verb的縮寫)PCR延伸技術

從PCR延伸出來的技術有很多,這裏只列舉幾個日常實驗中常用的。

1 .觸地PCR

登陸PCR主要用於優化PCR的條件。很多情況下,引物的設計給PCR帶來困難,比如特異性不夠,容易錯配。如果退火溫度太高,PCR效率會太低,但如果退火溫度太低,非特異性擴增會太高。

因此,先前循環的初始退火溫度被設定為比引物的最高熔化溫度(Tm)高幾度。在最初的幾個循環中,溫度逐漸下降到設定的最終Tm。在較高溫度下獲得高特異性匹配的模板後,在較低溫度下高效擴增。

2.逆轉錄聚合酶鏈反應

逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)的原理是從組織或細胞中提取總mRNA,用逆轉錄酶用Oligo(dT)或隨機引物將其逆轉錄成cDNA。然後使用cDNA作為模板進行PCR擴增,以獲得目的基因或檢測基因表達。

3 .實時PCR/定量PCR

實時熒光定量PCR技術是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監測整個PCR過程,最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

4 .巢式PCR

首先,使用低特異性引物進行幾個循環以增加模板的數量,然後使用高特異性引物進行擴增。

5.SOE PCR

重疊延伸PCR分為重疊延伸PCR定點突變和重疊延伸PCR序列缺失突變兩種,即重疊延伸PCR基因拼接(SOE PCR)。

5.1重疊延伸PCR定點突變(因為原理簡單,直接上圖)。

這壹步壹定要用Pfu酶,不能用Taq酶,因為Taq酶容易在PCR產物的末端加壹個A,會造成產物的移碼突變。

5.2通過重疊延伸PCR的序列缺失突變

6.高GC含量PCR

具有高GC含量(>:65%),由於G和C堿基之間的強氫鍵,DNA模板難以擴增。富含GC的序列也包括二級結構。因此,富含GC的序列會導致DNA聚合酶沿著模板“堵塞”,幹擾DNA合成。

為了擴增高GC含量的片段,必須解離雙鏈模板,這樣引物才能與模板結合,DNA聚合酶才能讀取序列。為了克服強烈的GC相互作用,最常見的方法是使用PCR添加劑如DMSO或輔助溶劑來幫助DNA變性。但這些試劑通常會降低引物的Tm,因此需要相應調整退火溫度。

高合成能力的DNA聚合酶由於與模板的結合能力更強,有利於完成高GC含量的PCR。超高熱穩定性DNA聚合酶也有利於高GC含量的PCR,因為更高的變性溫度(例如用98℃代替95℃)可能促進雙鏈解離和PCR擴增。

7.AS-PCR

PCR(等位基因特異性PCR (AS-PCR)是指引物與模板的堿基錯配可以有效抑制PCR反應,從而達到模板鑒別(等位基因鑒別)的目的。

因為在PCR中引物延伸從3’端開始,所以3’端的堿基對於引物延伸非常重要。如果這個堿基與模板互補,引物就可以連續延伸,PCR就可以正常進行,得到特定長度的擴增帶,否則就無法延伸。因此,只要將不同於正常等位基因的突變堿基排列在引物3’的末端,當含有突變序列的引物用於PCR時,如果獲得特異性條帶,則表明被測基因含有該突變。沒有出現特定的擴增帶,說明沒有這種突變。

註意:因為這裏只使用了引物3’末端的堿基錯配,所以需要找到合適的Tm才能達到檢測目的。

參考

Mullis,Kary B .等人“擴增、檢測和/或克隆核酸序列的方法”美國專利4,683,195。

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