壹、標本采集類型和要求
1，建議采集的呼吸道標本類型
發病後應盡快采集以下標本:鼻拭子、咽拭子、鼻吸出物和鼻灌洗。氣管插管患者還應收集氣管吸出物。標本應置於無菌病毒采樣溶液中，並立即用冰塊或冰排保存或置於4℃(冰箱)中，並立即送至實驗室。(臨床樣本采集人員和實驗室檢測人員的感染控制指南請參考相關文件。)同時填寫H1N1的疑似人感染病例樣本清單。(附表1)
2、棉簽的選擇
標本應使用帶有合成纖維頭(例如，聚酯纖維)和鋁或塑料手柄的拭子。不建議使用棉簽和木柄。標本采集管應含有3 ml病毒取樣液(含蛋白質穩定劑、防止細菌和真菌生長的抗生素、緩沖液)。
3、臨床標本保存要求
儲存在4℃(不超過4天)或-70℃或以下。有條件的實驗室應保持在-70℃或以下。不應儲存在-20℃下。
4、標本包裝處理
標本送到實驗室後，應立即處理，避免反復凍融。原始標本分為三份，壹份用於核酸檢測，壹份用於病毒分離，壹份保存待復檢。
5.標本的運輸
人感染甲型H1N1疑似病例定為A類，用UN2814包裝運輸。填寫《疑似人感染A型H1N1感染病例送檢單》(附表2)。
第二，核酸檢測
基於PCR原理的核酸檢測方法是壹種快速有效的診斷方法，在突發傳染病的應急工作中發揮了巨大作用。
1，基於實時RT-PCR的新型甲型流感病毒H1N1的檢測(引物和探針序列由疾控中心設計)；
4月29日，世衛組織網站公布了疾控中心針對這種甲型流感病毒設計的實時RT-PCR引物和探針。該實驗用於檢測疑似甲型流感病毒的呼吸道樣本。因此，建議使用這種實時RT-PCR方法首先篩查甲型流感病毒，排除季節性流感病毒和H5N1。實時RT-PCR方法見附件3(中文翻譯版)和附件4(英文原版)。
2.基於RT-PCR(國家流感中心設計的引物序列)檢測新型甲型流感病毒h 1n 1；
目前國家流感中心已設計RT-PCR檢測新型甲型流感病毒H1N1。RT-PCR的方法見附件5。
第三，病毒的分離和鑒定
雞胚和/或MDCK細胞可用於流感病毒的分離。具備相應條件的網絡實驗室應當在收到標本後24小時內進行病毒接種。具體方法見附件6和附件7。
四。甲型流感病毒H1N1對實驗室人員的生物安全
(1)實驗室水平和個人防護
1.在BSL-2實驗室對從疑似感染甲型流感病毒H1N1的患者采集的臨床標本進行診斷實驗。所有取樣操作應在生物安全櫃(BSC)中進行。遵循生物安全3級個人防護。
2.從疑似甲型流感病毒(H1N1)感染患者采集的臨床標本的病毒分離培養應在BSL-3實驗室進行，並遵循生物安全三級個人防護。
(2)健康監測
1，所有人員自測發熱等癥狀。
2.甲型流感病毒H1N1的癥狀包括咳嗽、喉嚨痛、嘔吐、腹瀉、頭痛、流鼻涕和肌肉疼痛。如果妳感到不適，妳應該立即向妳的上級報告。
3.如果任何人在沒有防護的情況下暴露於甲型流感確診病例(H1N1)的臨床標本或活病毒，應在暴露後7天內考慮使用奧司他韋或紮那米韋進行抗病毒預防。
動詞 （verb的縮寫）附表和附件
附表1疑似人感染甲型H1N1樣本表
附表2疑似人感染A型H1N1感染的標本
附件3:實時RT-PCR檢測甲型H1N1流感病毒操作規程(2009年版)(中文)
附件4:實時RT-PCR檢測甲型H1N1流感病毒的操作規程(2009年版)(英文)
附件5:用RT-PCR檢測甲型流感病毒
附件6:甲型流感病毒H1N1雞胚分離方法
附件7:甲型H1N1流感病毒MDCK細胞的分離方法
附表1
姓名、性別、年齡、職業※現住址、發病日期標本#
物種標本數量
(g或ml)采集
日期備註※選項:參考傳染病報告卡。
#選項:A鼻咽拭子，B鼻咽抽吸物，C鼻腔灌洗液，D鼻腔抽吸物，E氣管抽吸物，F其他(如果是其他，請在表格中註明)。
采集人員:采集單位(蓋章):
附表2
姓名、性別、年齡、職業※、現住址、發病日期#
樣本數量*
(g或ml)采集
日期備註※選項:參考傳染病報告卡。
#選項:A鼻咽拭子，B鼻咽抽吸物，C鼻腔灌洗液，D鼻腔抽吸物，E氣管抽吸物，F其他(如果是其他，請在表格中註明)。
*標本數量:如果同壹標本有多個包裝，請註明。
填表:送樣時間:單位(蓋章):
附件3
實時RT-PCR檢測甲型流感(H1N1)的操作規程。
中文翻譯(請同時參考英文原文)
請註意:請參考試劑盒供應商提供的系統建立說明。本規定中的制度僅供參考。
美國疾病預防控制中心豬流感實時RTPCR檢測操作規程(2009版)
本程序的所有權屬於疾病控制中心，並授權公共衛生實驗室在緊急情況下使用。本規定不得用於商業活動或營利目的。
壹.概述
(壹)前提
這個程序是基於對rRT-PCR方法的基本掌握。
(2)實驗原理
實時熒光定量RTPCR檢測豬流感的方案是使用壹套寡核苷酸引物和TaqMan & amp；reg呼吸道樣本或體外培養物中豬流感病毒的探針、定性檢測和鑒定。InfA引物和探針設計用於檢測甲型流感病毒，swInfA引物和探針可特異性檢測所有豬流感A病毒，swH1引物和探針可特異性檢測豬流感H1亞型病毒。本實驗用於檢測甲型流感陽性的疑似豬流感感染病例的呼吸道樣本..
(3)使用條件
壹步定量RT-PCR 96孔板熱循環系統。
(4)生物安全要求
樣品處理應在相應的生物安全實驗室完成。
(5)樣品要求
1，呼吸道樣本
支氣管肺泡灌洗液、氣管抽吸物、痰、鼻咽或口咽灌洗液或拭子。拭子樣本中使用的拭子頂部應由人造材料(如聚酯或聚酯)制成，手柄應由鋁或塑料制成。不建議使用棉頭木柄的棉簽。藻酸鈣拭子取樣是不可取的。
2.排除標準
1)未儲存在2-4°C(≤4天)或-70°C或以下的樣品。
2)以上未列出的其他不合適的樣品。
(6)核酸提取
RT-PCR的擴增效率取決於樣品模板RNA的質量和數量。RNA提取操作應在核酸純度合格後用於樣品實驗。商業操作程序包括QIAAMP &；reg病毒RNA提取試劑盒；reg小試劑盒(QIAGEN公司)、羅氏MagNA Pure Compact RNA分離試劑盒、MagNA Pure LC RNA分離試劑盒II、羅氏MagNA總核酸純化試劑盒，在推薦的操作程序下可以提取高純度的RNA。
(7)免責聲明:所提及的制造商名稱僅作為示例，不代表其獲得了CDC的認可。
二、實驗材料
(1)試劑
1，壹步熒光定量RT-PCR探針試劑盒；
2.分子無菌蒸餾水(不含RNase和DNase)；
3.正向和反向引物(40 μm)；
4.雙標記探針(10 μm)；
5.陽性對照。
(2)供應
1，實驗室記號筆；
2.微量離心管柵，96孔0.2ml PCR反應管；
3、20μl和200μl可調移液器和過濾頭；
4.0.2ml PCR反應管平板；
5.光反應蓋板；
6、無菌、無核酸酶1.5 ml微量離心管；
7.壹次性無塵手套。
(3)儀器設備
1.微型離心機；
2.渦流振蕩器；
3.實時熒光定量PCR檢測系統，包括96孔熱循環反應板。
三、操作程序
(1)準備工作
1.避免樣品汙染
由於熒光5’核酸酶測定的敏感性，應特別註意假陽性的產生。建議采用以下汙染預防方法:
1)實驗準備和核酸提取使用獨立區域；
2)特殊設備(如移液器、微量離心機)和耗材(如微量離心管、吸頭)用於實驗準備和核酸提取；
3)實驗結束後穿戴幹凈的工作服，使用新的壹次性無粉手套；
4)在不同的樣品操作之間以及在懷疑汙染的情況下更換手套；
5)試劑和反應管的蓋子應盡可能關閉。
2、儀器準備
工作臺、移液器和離心機必須用清潔劑清潔和凈化，如5%漂白劑、“DNAzap”或“RNase away &；reg”以降低核酸交叉汙染的風險。
3、試劑準備
註意:在測試過程中，將所有試劑低溫保存在冰架上。
1)引物和探針
(1)將包裝好的冷凍引物和探針融化(融化後的探針在2-8℃的暗處最多可保存3個月，不要反復凍融探針)；
(2)渦旋振蕩引物和探針；
(3)引物和探針瞬時離心，然後放在冰架上。
2)用於2)實時RT-PCR的試劑
(1)把Master Mix和酵素放在冰架上；
(2)熔化2×反應混合物；；
(3)混合2×反應混合物；上下顛倒；
(4)立即離心2倍反應混合物和酶，並將其放在冰架上。
4.檢測RT-PCR的每壹步。
1) RNA提取物分別用引物和探針檢測:INFA、SWF Lua、SWE H1 (SWH 1)和RNaseP (RP)。RNaseP引物和探針以人RNaseP基因為靶基因，因此可以作為人核酸的內部陽性對照。
2)為每個過程中包括的所有引物和探針建立無模板對照(NTC)和陽性模板對照(PTC)。
3)人類樣本質控品(HSC)提供二級陰性質控品，以確認核酸提取過程和試劑的完整性。
5.建立反應
將反應檢測混合物充分混合，然後加入到96孔板中。然後，將水和提取的核酸或陽性模板對照(PTC)加入適當的實驗反應和對照中。
1)為每個引物和探針標記壹個1.5ml微量離心管；
2)確定每個已建立反應的反應數(n)。考慮到NTC、PTC、HSC反應和吸附誤差，需要制備過量的反應混合物。詳情如下:
(1)如果樣本數(n)的範圍是1到14，那麽n = n+1；
(2)如果樣本數(N)大於15，包括對照，則N=n+2。
3)主混合物:計算添加到每種引物/探針反應混合物中的每種試劑的量。計算如下:
*請參考套件供應商提供的系統建立說明。
4)加水後，上下吹氣使反應混合物混合均勻，無漩渦振蕩。
5)離心5s，使混合物聚集在試管底部，然後將試管放在冰架上；
6)準備壹個板狀反應管或96孔板，放在冰架上；
7)每個主混合液每個孔吸20μl，每行按順序進行，如下圖所示:
實驗建立的例子:
實驗樣本示例:
註意:在添加任何樣品之前，應添加陰性模板對照(NTC)(1列)以測試主混合物中的汙染。應在待測樣品(11列)後添加HSC，以檢查樣品制備或添加過程中的交叉汙染。陽性模板對照(PTC)應加在所有樣本和陰性模板對照(NTC)之後。
8)在將培養板移動到核酸處理區域之前，在實驗設置區域中的反應板的第壹列中進行NTC反應。如上所述。
9)吸取5μl無核酸酶的水到NTC孔中，並蓋住NTC孔。
10)覆蓋反應板，並將其移至核酸處理區。
11)將裝有樣品的試管渦旋5s，並瞬時離心5s；
12)將提取的核酸樣品放在冰架上；
13)如上所述，樣品要按列加入，第壹個樣品5μl要吸到所有標有該樣品的孔中(如上表所示樣品“S1”)。不同樣品之間需要更換槍頭。
14)加樣後的孔要蓋好，這樣有利於防止樣品的交叉汙染，也便於操作人員記錄加樣的具體過程；
15)為了避免交叉汙染，必要時更換手套；
16)對其余樣本重復步驟13-15；
17)向HSC孔中加入5μl HSC樣品(11列)。蓋住HSC孔。
18)最後，向所有PTC孔中加入5μl陽性模板對照RNA，並覆蓋PTC孔。
19)如果用的是8管的條形板，每條都要貼標簽標明每個樣本的位置(不要標反應管頂部！)。瞬間離心條管10-15s，然後放在冰架上。如果使用培養板，4℃離心500g 30s，放在冰架上。
6.RT-PCR擴增條件
反應體系為25ul，反應條件如下:
註意:熒光信號(FAM)應該在55度的步驟中收集。
*具體擴增條件請參考試劑盒供應商提供的說明書。
7.解釋/檢查
1)探針/引物陰性對照反應中得到的熒光生長曲線不應超過閾值線。如果壹個或多個引物和探針的陰性反應是假陽性，樣品可能已經被汙染。然後整個實驗過程無效，嚴格按照步驟規則重復實驗。
2)在37個周期或之前，所有臨床樣本的RP響應曲線應超過閾值線，這表明已經從人RNase P基因中擴增出足夠量的RNA，且樣本質量合格。但是，由於初始臨床樣本中的細胞數量較少，壹些樣本可能沒有陽性結果。同時，從動物/鳥類或通過細胞培養獲得的樣品在RP反應中經常沒有結果或結果微弱。如果RNase P在所有臨床樣本中均為陰性，則意味著:
(1)臨床材料核酸提取不當導致臨床樣本RNA丟失或RT-PCR抑制劑殘留汙染；
(2)沒有足夠的人體細胞用於測試；
(3)方法制定和實施不當；
(4)試劑和儀器。
HSC組在40個周期內，InfA、swFluA和swH1探針的熒光生長曲線不應超過閾值線。如果任何壹種流感特異性探針的生長曲線超過閾值線，則有以下解釋:
(1)可能是由於RNA提取試劑的汙染。實驗前確保RNA提取試劑正確。
(2)交叉汙染發生在2)RNA提取或樣品添加期間。嚴格按照操作規程的要求重復實驗。
(3)在40個循環之前，PTC反應的INFA、SWNFA、SWH1和RP反應應呈陽性結果。如果沒有產生預期的陽性結果，則視為無效，應嚴格按照操作規程重復實驗。確定PTC反應失效的原因，修改並記錄錯誤原因和更改方案。不再使用不產生預期結果的PTC試劑。
(4)當所有質控品均符合要求時，如果InfA反應生長曲線在40個循環內越過閾值線，則認為樣品為甲型流感病毒陽性。如果甲型流感病毒呈陽性，Univ SW和/或SW H1也可能呈陽性。如果InfA和特定亞型反應(swInfA和swH1)的反向生長曲線在40個循環內越過閾值線，則認為樣品對豬流感病毒A/H1呈陽性。如果樣本只對InfA和壹種亞型呈陽性，或只對InfA呈陽性，請聯系CDC尋求進壹步指導。
(5)在所有質控品均符合要求的前提下，如果待檢樣品的所有InfA反應在40個循環內均為陰性，則該樣品視為陰性。
8.限制和規定
1)實驗人員在實際操作前要經過操作規程和測試結果分析的培訓，熟練掌握後才能進行實驗。
2)當樣本量不足時，可能產生假陰性結果，可能是由於采集、運輸或處理不當造成的。
3)如果反應中有太多的DNA/RNA模板，也可能出現假陰性。如果樣品的RP反應被抑制，提取的RNA可以被稀釋2倍或更多倍(例如，1: 10或1: 100)以重復實驗。
9.評論
引物和探針在英文版P7中顯示。
附件4
實時RT-PCR檢測和鑒定甲型H1N1流感病毒的操作規程。
(英文版)
附件5
RT-PCR檢測新型甲型流感病毒H1N1
壹.目的
對采集的可疑病例樣本進行檢測，篩查甲型流感病毒H1N1，排除季節性流感病毒H1N1。
二、引物NIC引物名稱堿基組成目的片段大小備註flu afula-M-f 30 ttctaaccgagggtcgaaacg 235 BP通用檢測引物Flua-M-r 264 aaaggcgtctacgctgcag h 1hah 65 438+0f 1147 aagagcacatatgccat 527 BP h 1n 1通用引物h 1r 1r 6543868 ACTGGACTCTGCTGGAAC 327 BP人季節性流感病毒H1N1亞型檢測引物h 1HA r 1094 aatgaaccggcaatgtcc SWH 1HA-1SW-h 1F。786 aataacattagacacactgg 153 BP甲型流感病毒的引物SW-h 1n 1r 920 aggctgtttatrgcac RNase F agattgga CCT GCG。AGC G約80bp，與實時PCR中的RnaseP引物壹致。CGG CTG TCT CCA CAA GT三。材料和儀器。
1，RNA提取試劑盒qiagen rneasy迷妳試劑盒(目錄號74104)
2.β-巰基乙醇(適馬β-巰基乙醇批號062k0115)
3.70%乙醇
4、RT-PCR試劑盒:QIAGEN壹步法RT-PCR試劑盒(目錄號210212)
5、核糖核酸酶抑制劑(Promega目錄號N2111)
6.引物檢測
7.Axygen 1.5mL離心管，貨號:MCT-150-C
8.Axygen 0.2mL PCR管，貨號:PCR-02-C。
9.帶濾芯的Axygen 10微升、100微升、200微升、1000微升針頭。
10，10微升，100微升，200微升，1000微升取樣器
離心機11，轉速14K可調；
12，渦流混合器:
13，生物安全櫃:二級生物安全櫃。
14，PCR儀:
15，瓊脂糖:Genetech(上海)有限公司經銷的biowest瓊脂糖，批號101685。
16，核酸染料:
17.電泳液:5×TBE電泳緩沖液目錄號9009032718。電泳槽和電泳設備。
四、實驗步驟
(1) RNA提取
1.根據樣品數量分裝RLT溶液:從試劑盒中取出RLT溶液，分裝於1.5mL離心管中，每管500μL(在系統準備區操作)。
2.加入100μL采樣液(鼻拭子、咽拭子、胸腔積液等。)或病毒培養物(雞胚尿囊液或細胞培養液)註入生物安全櫃中的RLT液體管中，並充分混合。
3.每管加入5μL β-巰基乙醇，混合後依次加入600μL 70%乙醇，充分混合。
4.從試劑盒中取出2mL帶過濾柱的收集管，打開包裝並做好標記。向過濾柱中加入600μL步驟(3)中的混合液，以65438±02000 rpm離心65438±05s，棄去收集管中的離心液。
5.將過濾柱放回收集管上，以12000轉/分的速度將步驟(3)中剩余的混合液全部吸入過濾柱，離心15s，棄去離心液。
6.向過濾柱中加入700μl washbuffer rw 1溶液，12000rpm，離心15s。
7.從QIAGEN RNeasy Mini試劑盒中取出壹個幹凈的2mL收集管，將離心過濾柱移至壹個新的收集管中，加入500μL洗滌緩沖RPE溶液，12000rpm，離心15s。
8.棄去收集管中的離心液，然後在過濾柱中加入500μL洗滌緩沖RPE液，以13000~14000rpm離心2分鐘。
9.將濾柱移至幹凈的1.5mL eppendorf管中，向濾柱中加入30~50μL無核糖核酸酶的水，室溫下靜置1~3min。
10，12000轉/分，離心1分鐘，收集離心液即為提取的病毒RNA，立即做實驗或保存於-20℃以下。
註意:在使用RPE緩沖液之間加入44毫升無水乙醇。
(2)反應體系的準備
1，實驗設計:
樣本RNA的檢測
質量控制參數:
陰性對照:無菌水(標本提取RNA時，與標本同時提取無菌水。)
陽性對照:已知病毒RNA
2.PCR反應系統的制備(在系統制備區制備反應溶液)
1)根據下表添加試劑:
PCR反應體系的組分體積(μL)無RNase水
5×RT-PCR緩沖液11.9×n
5×n 10mm dntp mix 1×nen zyme mix 1×nrna se抑制劑0.1× nUpstream引物0.5× nDownstream引物0.5× nTotal 20×確定每個已建立反應的反應數(n=要進行的PCR管數，包括陰性反應。考慮到陰性無模板對照、陽性對照和誤差，需要制備過量的反應混合物。詳情如下:
(1)如果樣本數(n)的範圍是1到14，那麽n = n+1；
(2)如果樣本數(N)大於15，包括對照，則N=n+2。
2)將上述反應液混合均勻，分裝於0.2mL PCR管中，每管20μL，分別標記。
3)添加RNA模板(在核酸提取區)
將模板添加到上述單獨包裝的PCR細管中。首先加入陰性對照試管(5μL無菌水)，然後加入樣品RNA(每管5μL)，最後加入陽性對照RNA(每管5μL)。
3.RT-PCR反應
將反應管與模板混合均勻，短時間離心，放入PCR儀中進行RT-PCR。
擴增，反應程序如下:溫度(°c)，時間循環數60℃1min 1min 50℃30min 95℃15min 94℃30s 3552℃30s 72℃1min 72℃7min 65438。
1)2.0%瓊脂糖凝膠的制備:稱取2.0g瓊脂糖，倒入耐熱玻璃瓶中，加入100 ml電泳液(1× TBE)，輕輕攪拌，加熱至瓊脂糖完全熔化。當瓊脂糖膠溫度降至50 ~ 60℃左右時，加入核酸染料，輕輕攪拌(無氣泡)。當膠溫降至50℃左右時，倒入制膠板，插入電泳梳。膠水完全凝固後(約30 ~ 60 min)，拔出梳子。
2)將制備好的電泳凝膠放入電泳槽中(有梳孔的壹端在陰極)，倒入電泳液(1×TBE)浸泡凝膠表面。
3)分別取10μL PCR產物，加入2μL上樣緩沖液(6×上樣緩沖液)，混勻，然後加入電泳凝膠孔中(先加入5 μ l標記物(DL-2000)，然後依次加入樣品PCR產物，再加入陰性對照產物，最後加入陽性對照產物)。
4)電泳電壓為100V，大約30 ~ 40 min後會看到結果。
5)將電泳凝膠放入凝膠成像系統觀察結果並拍照。
5、結果判斷
在系統成立的情況下，即陰陽兩界參照正常的情況下，每條引物所代表的含義如下:PCR引物樣品1樣品2樣品3樣品4樣品5樣品6 flua _ +++/-h 1HA _+/-huh 1HA _ _+_+/-SWH 1HA-1 _ _+/-RNA sep +++++結果判斷非流感
非H1N1亞型人季節性H1N1亞型豬H1N1亞型流感病毒。
送到國家流感中心復查。送到國家流感中心檢測的樣本不是人源的/樣本中細胞很少/實驗或儀器有問題。