繼1983年人類首次獲得煙草和馬鈴薯的轉基因植株之後，1988年McGrananhan等〔1〕
獲得了首例轉基因果樹—具‘US基因的核桃，1990年他們獲得了具抗蟲基因的核桃。在人
們利用基因槍法獲得大田作物轉基因之後3年，基因槍法即在番木瓜上得到成功應用［2］
。 1994年Kalinski統計了轉基因植物的專利，計有巧種植物，蘋果也名列其中。國內研究者
十分重視轉基因研究。黃學森等〔3〕發表了葡萄的遺傳轉化;程家勝等〔4〕
介紹了蘋果基因轉移技術;隨後將Bt基因導人‘綠袖’及‘金矮生’蘋果中獲得了轉基因蘋果苗[5j;傅潤民等較系
統地介紹了基因工程及其在果樹上的應用[6，7〕
;中國熱帶農科院熱帶作物生物技術國家重點
實驗室在番木瓜轉基因上開展了工作〔8~11〕
;中國農科院柑桔所和華南農業大學開展了抗菌膚
基因導人柑桔的研究〔12,13〕;沈陽農業大學獲得了蘋果主栽品種‘新喬納金’的轉基因植株〔14~16〕
福建農業大學開展了龍眼〔17〕、西番蓮〔18〕
和批把等亞熱帶果樹的遺傳轉化和轉基因研究;華
中農業大學等在方法學上促進了果樹基因工程的進展〔19，20〕
。開展轉基因或遺傳轉化的還有
不少單位〔21~24〕
。果樹的轉基因研究已成為壹個熱點。作者試就迄今果樹轉基因文獻綜述於後，也就壹些問題提出看法，失當之處歡迎批評指正。 二 植物基因轉化的方法 1.1農桿菌介導的基因轉化法
目前已探討的各種基因轉化方法中，農桿菌基因轉化法是研究最清楚的壹種〔25〕
。這種方法是利用自然界的天然遺傳工程體系即根癌農桿菌(Agrobacteriumtum代f玫ciens)和發根農桿菌(Agrobacteriumrh挽ogl’ne:)的發病過程，將人為加工的基因轉人植物細胞。根癌農
桿菌侵染植物引起冠瘦瘤(Crowngall)。冠瘦瘤有兩種狀態〔26〕
，壹是無組織的腫瘤，在無激素培養基上不斷增殖，但無頂端優勢且難以生根，與冠瘦瘤誘導有關的質粒為Ti質粒(Tum。:inducingplas-mid)。發根農桿菌侵染植物可在感染部位產生眾多的發狀根(Hairyroots)，與此有關的是Ri質粒(Rootinducingplasmid)。只有能夠被農桿菌感染的植物才可以利用農桿菌作為基因載體。農桿菌的主要侵染對象是雙子葉值物，單子葉植物對這兩種病菌壹般不太敏感，但最近也有不少感染致病的例子，裸子植物也可以進行人工接種感染致病。
目前常用的農桿菌轉化方法有3種〔
25〕
：(1)直接感染植物傷口:將新萌發的種子、幼胚、子葉或莖段用刀切出壹個傷口，接上過夜培養的農桿菌，然後在無激素的培養基上培養腫瘤組織。此方法實驗周期短，但腫瘤組織中常有未轉化細胞，易形成嵌合體。(2)葉盤轉化法:在幼嫩新鮮的葉片上用打孔器取下直徑為3壹smm的葉盤，在過夜培養的農桿菌菌液中浸數秒後，轉移到培養基上***培養2壹3d，再將葉盤轉移到加有抗菌素的選擇性培養基上，誘導苗的分化，使轉化細胞直接再生植株。此方法簡單易行，可快速獲得轉基因植株。(3)原生質體***培養法:當原生質體再生出細胞壁並進行分裂的時侯，其行為與植物傷口細胞相似，此時農桿菌可以感染原生質體。在原生質體中加人農桿菌(1:100比例)其培養24~40h後，離心去菌，在選擇培養基上培養，誘導愈傷組織再生植株。由於原生質體的遺傳均質性，轉化細胞是單個獨立細胞，得到的轉化體壹般不會有嵌合現象，在應用方面具有重要價值。 1.2DNA直接轉化
由於農桿菌宿主範圍的局限性，使占農作物主要部分的禾谷類難以被農桿菌轉化。因此在80年代發展了DNA直接導人技術，即用裸露DNA經特殊的處理直接轉移到植物體中。
1·2.1聚乙二醇轉化法(Polyethyleneglycol:PEG)PEG是原生質體融合的媒介劑，能影響原生質膜的通透性，在占質粒DNA***培養時，致使原生質體主動吸收外源DNA分子，外源基因能整合到植物基因組進行表達和傳遞。用PEG處理後，大量的原生質體和DNA分子相互接觸，再經高Ca“+和高pH溶液作用時，原生質膜的電荷重新分配，表面出現壹些暫時可變性孔隙，DNA分子進人原生質體內。當用培養液沖洗原生質體使PEG、高CaZ+和高pH條件改變後，原生質體恢復原來的形態，進入原生質體後的DNA分子可以進入細
胞核內，整合到染色體上〔25〕
。此方法相對簡單易行，不需要昂貴的儀器設備，但要具有原生質體制備、培養和再生系統。
1.2.2電穿孔法(Electroporation)將原生質體和DNA分子混合於緩沖液中，並置於小小 的器皿內，用短時、高脈沖電處理，導致細胞膜出現可恢復性孔隙，從而發生新的滲透孔(3壹4nm)，由此使和原生質體膜直接接觸的DNA分子進人細胞。質膜上可逆孔隙的大小和數量取決於電場強度和刺擊時間長短。此方法目前多限於標記基因，目的在於建立高效的轉化
體系巨〔27〕
。
1·2·3基因槍轟擊法(Genegunbombardment)又稱粒子轟擊法(partielebombardment)或高速粒子微噴射技術(Hightveloeitypartielemieroprojeetion)，是壹種機械轉移基因的方法。采用加人Ca’+和亞精胺等使DNA吸附在鎢金微粒表面，制成DNA壹微彈，在基因槍激發的瞬間力量作用下，進人植物細胞中。此方法最大優點是其應用的廣泛性。但由於受轟擊速度、靶細胞距離、微彈直徑、速度、射擊的擴散半徑、外源DNA的量及結構等因素的影響，轉化頻率低，同時存在價格昂貴、嵌合體不易排除，不易選擇轉化體等因素，使其應用受到限制。
1.2.4其它轉化方法除上述常用方法外，還有顯微註射法(Microinjection)、花粉管通道(Pollentubepathway)、脂質體融合法(Liposomefusion)、超聲波沖擊法(Ultrasonieation)、微激光法(Mierolasar)電泳法(EleetrophoresiS)等被應用於植物基因轉化。 三 影響果樹基因轉化的因素
2.2.1 農桿菌的侵染能力及載體的影響
農桿菌的侵染能力與轉化率有著直接的關系,也是轉化成敗的主要因素之壹。農桿菌的侵染能力取決於農桿菌本身的特性及受體植物對它的敏感性。就農桿菌而言,其侵染能力與農桿菌種類及載體質粒的結構有關。農桿菌分三大類菌系,即胭脂堿型( Nopalinetype ,Nop)、章魚堿型(Ocopine type,Oct)及農桿菌堿型( Agropine type )亦稱琥珀堿型(Succinemopine type, Suc)。Nop型菌株的特點是染色體背景為C58,生長速度快、不結球、易操作,常用的工程菌株有C58、pGV3850、A208SE等。Oct型菌株的特點是其染色體背景為Achs,生長慢,菌株培
養過程中結球,在轉化實驗中不利於操作,***培養後不易洗掉,常用的工程菌株有LBA4404、LBA104。Suc型菌株的特點是染色體背景為A281或A136,具有Nop型菌株的特點,常用的工程菌為EHA101和EHA105,它們具有生長快、不結球等優良特性,這兩種菌株的侵染能力都很強。我們進行了菌株種類對多種果樹的侵染能力比較研究,結果表明EHA105是理想的果樹基因工程轉化載體系統,該菌株具有生長快、不結球、轉化中易操作、***培養後易洗脫、對Cef敏感、侵染能力強、寄主範圍寬等特性。我們利用該菌株已成功獲得了蘋果、櫻桃、草莓等多種轉基因植株。 2.2.2 農桿菌vir基因的活化
vir基因的活化是農桿菌轉化的域閥。vir區有virA、B、C、D、E、F、G、H 7個操縱子***24個基因,***同起調控作用,它們與T-DNA的加工和轉移有關。vir區基因的活化在農桿菌轉化中的作用十分重要,因此凡能增強vir基因活化的因子都能提高其侵染能力。常用的vir基因誘導物是乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)。關於誘導物的使用常采用以下3種方法:①在農桿菌液體培養時加AS,加入時間壹般在制備工程菌侵染液使用前4~6小時加入。②AS加在農桿菌和外植體***培養的培養基中③在農桿菌液體培養基中及***培養基中都加入AS。這種方法似乎最牢靠,只不過是使用的AS誘導劑太多了。然而,也有很多實驗表明不加誘導物同樣可以實現轉化的目的。另外在蘋果葉片轉化中發現,與AS同時加入誘導穩定劑甜菜堿(lmmol/L)或脯氨酸(lumol/L),對vir基因活化有協同作用。研究發現, pH值對vir區的活化有著明顯的影響,從理論上講含AS的培養基pH值為5.0~5.6時,vir區基因的誘導達到最高水平,pH值改變0.3,即對多種植物的轉化率有明顯的影響。章魚堿型和農桿菌堿型菌系比胭脂堿型需要更低的pH值。通常農桿菌培養時pH值為7.2。這種生長旺盛的菌株vir基因均處於不活化狀態。植物組織培養基中的pH值常為5.8,有利於vir基因的活化。在vir基因活化 誘導中應註意調整培養基的pH值。此外,vir基因活化還受到其他因素的影響,如溫度,virD及virG的活化必須低於28℃;培養基中還應加酵母提取液;培養基中的糖或高濃度的肌醇可促進vir基因表達。
四 植物轉基因研究中存在的問題及解決之法
通過轉基因技術可以優化植物的農藝性狀,獲得良好的經濟效益,並且已經取得了舉世矚目的成就..盡管如此,植物轉基因研究中還存有壹些潛在問題. 3·1 食品安全性問題
把影響蛋白酶活性的抑制劑基因導入植物體後,能夠使取食其葉片的昆蟲的消化功能受到損害,那麽轉基因植物的葉片、果實、種子等是否會對人畜產生類似的傷害?其他種類的基因導入植物體後,對人畜會產生怎樣的後果?盡管目前還沒有直接證據證明轉基因植物是否對人畜有害或其危害程度,但這種疑慮使人擔心. 3·2 病蟲的抗藥性問題
病蟲的抗藥性問題是困擾農業生產的重大問題.最近研究表明,若每年噴施蘇雲金桿菌殺蟲劑10~20次,5年後害蟲死亡率降低50%,其半死劑量提高10倍.如果大規模種植能自行產生蘇雲金桿菌毒蛋白的轉基因植物,類似情況有可能會發生.此外,由於生物***同進化,抗性植物在逆境條件下能夠生存,那麽病蟲也會很快發展其對不良生境的適應性,從而使轉基因植物逐漸失去對病蟲的抗性. 3·3 環境生態平衡問題
目的基因導入植物後,使其性狀得以改良.但這些基因如果被壹些野生植物尤其是壹些雜草俘獲,就會產生壹些新的雜草類型.如:除草劑對已俘獲了抗除草劑基因的雜草不再具有除草性能.如果抗逆基因被雜草俘獲,就會增強其對環境的適應性和生存競爭能力,而使其加劇繁衍蔓延,壹些稀有植物種會由於競爭替代而消亡,同種植物的遺傳多樣性便會減少,昆蟲群落也會受到影響.
盡管轉基因研究會引發上述問題,但隨著研究的不斷深入,人們會尋求新的對策來解決這些問題.通過立法等手段來加強轉基因研究的管理,以使轉基因研究所帶來的負面影響減小到最低.通過時間、空間和遺傳隔離等方法,可以基本控制植物基因的擴散,降低其對生態環境所帶來的危害.
五 轉基因技術的展望
定點、定量將外源基因導入受體細胞基因組DNA中,獲得穩定、高效表達和遺傳的新個體是轉基因研究的主要目標.並且隨著生物技術產業化進程的加快,轉基因技術將會產生越來越重要的作用.
(1)利用多基因轉化培育超級抗病蟲害新品種 許多病毒、真菌、細菌及害蟲不僅給果樹生產造成巨大的經濟損失,而且農藥的大量使用造成了環境的汙染。現已克隆出許多抗病蟲害的基因,如cp、bt、icp、cpti、抗菌肽、幾丁質酶及雪蓮凝集素、PRP基因等,為培育抗病新品種打下了基礎,但是這些基因的專壹性很強,只能對某壹類病蟲害有效。近年來植物基因工程的重要進展是構建了人工染色體載體,建立了多基因轉化系統,實現了多基因轉化。這些新進展為果樹導入多個不同類型的抗病蟲害基因打下基礎,為培育普抗病蟲害的超級新品種開辟了新的途徑。
(2)利用基因工程培育砧木新品種 砧木新品種的育種是果樹重要研究課題。果樹的抗逆性、矮化、豐產性、生根能力等都與砧木有關。現在已有許多抗逆基因、生根激素基因、矮化基因等,把這些基因導入現有的砧木將有力推動果樹產業的發展。而且,砧木基因工程育種幾乎不存在轉基因的安全性問題,容易被社會接受。
(3)利用反義基因操作培育耐貯的新品種.根據反義RNA的原理,人工構建反義基因導入細胞,表達能與靶mRNA互補的部分序列,並與其配對結合形成復合物,從而阻斷DNA經過RNA到蛋白質的信息流,調控靶基因表達。反義基因操作技術在植物基因工程方面的應用已取得可喜的成果。
(4)改良水果的品質 迄今已克隆出許多與果實品質有關的基因,如果聚糖合成酶基因、海藻糖合成酶基因、甜蛋白基因、賴氨酸等必須氨基酸合成酶基因等,把這些基因導入果樹將培育出優質新品種。