核酸提取均采用磁珠法。
1)磁珠提取的原理:
將磁珠上標記特異性吸附核酸的物質特異性吸附核酸,並通過磁分離技術將病毒核酸從裂解液中提取出來。
2)步驟:
裂解—吸附—洗滌—洗滌—洗滌—洗脫
3)優點:
a.磁珠提取特異性高,受標本因素影響小,靈敏度高
b.易於實現自動化
4)缺點:
a.成本較高、並需要壹定的儀器(半自動、全自動)。
b.完全手工工作,工作量太大。 根據HIV-1 gag.pol和env基因序列設計了套式聚合酶鏈反應(nesled polymerasechain reaction,nPCR)引物。將外周血單個核細胞裂解液先用外側引物擴增,其產物再經內側引物擴增,直接走凝膠電泳判定結果。nPCR的敏感性。較常規PCR高100~1000倍,可檢測到0.5fg質粒DNA和50μ1HIV-1感染者外周血樣中的HIV基因。
根據專業文獻記載,用本法檢測63名HIV-1感染者全為陽性,而61名健康人和可疑者均為陰性,後者經追蹤檢測抗體排除了HIV-1感染。
由此可知,nPCR是壹種敏感性極高、特異性很強、操作簡便易行的HIV-1基因檢測技術。它已經在早期診斷和外周血病毒含量檢測中發揮了重要作用,而且有著更廣闊的應用前景。
檢測的優點
人體感染艾滋病病毒後,壹般需要2-12周,平均42天左右血液中才可檢測到HIV抗體。在這段時期內,常規檢測技術根本無法檢測出HIV病毒,這就是常說的“HIV窗口期”。“窗口期”的存在,也解釋了為什麽壹些病人在接受了正規醫院輸血後卻感染艾滋病的原因。
在感染過程中,首先出現的是病毒RNA,這時可以用PCR的方法檢測出來,之後出現的是IgM抗體,使用雙抗原夾心法即可以檢測出來,然後出現的是IgG抗體,使用間接法可以檢測出來。
現在省市疾病控制中心和檢測試紙,使用的檢測方法都是檢測抗體抗原,無法避免“HIV窗口期”因素的幹擾。所以說,常規檢測技術在HIV窗口期內存在重大缺陷。